PRV EP0基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒與PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起多種家畜與野生動(dòng)物以發(fā)熱，奇癢，腦脊髓炎，流產(chǎn)及死亡為主要特征的急性傳染病。豬是該病的貯存宿主和主要傳染源，豬感染PRV后常表現(xiàn)為哺乳仔豬死亡、育肥豬生長(zhǎng)停滯及妊娠母豬繁殖障礙。該病在歐洲、亞洲等多個(gè)國(guó)家呈蔓延趨勢(shì)，已給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，中國(guó)尤為嚴(yán)重。PRV屬于雙鏈DNA病毒，大小約150 Kb，可編碼70-100

2、種蛋白質(zhì)，其中EP0蛋白是PRV重要的早期蛋白。EP0蛋白包含與鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)似的環(huán)指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域主要是結(jié)合DNA、RNA及蛋白質(zhì)之間相互作用的區(qū)域，推測(cè)它在病毒與宿主相互作用方面具有重要意義。本研究構(gòu)建了pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒和PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù)，為更好的研究PRVEP0蛋白與宿主細(xì)胞PK-15之間的相互作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　第一部分:構(gòu)建pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒
　　采用PCR技術(shù)，

3、擴(kuò)增獲得PRV EP0基因，將其克隆至酵母雙雜交載體pGBKT7中，獲得重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切鑒定與基因測(cè)序結(jié)果分析，表明成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)其進(jìn)行毒性檢測(cè)，自激活效應(yīng)檢測(cè)，PCR以及Western-blot檢測(cè)，結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性作用，無(wú)自激活效應(yīng)，PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)

4、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，并且能夠表達(dá)融合蛋白BD-EP0-Myc。
　　第二部分:PK-15細(xì)胞cDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定
　　選取PRV的宿主細(xì)胞PK-15細(xì)胞來(lái)構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。本試驗(yàn)從PK-15細(xì)胞提取總RNA，采用SMART和LD-PCR合成全長(zhǎng)的dscDNA，并對(duì)其進(jìn)行均一化和SfiⅠ酶切處理。將得到的ds cDNA連接到三框表達(dá)載體中。將這三個(gè)重組反應(yīng)產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到HST08電

5、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建含有三種讀碼框的初級(jí)文庫(kù)，該文庫(kù)庫(kù)容分別為3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，插入片段均在500 bp以上，陽(yáng)性重組率均大于93％。再將三框初級(jí)文庫(kù)共同電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞HST08中進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒文庫(kù)。最后將質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞，得到的cDNA酵母文庫(kù)總庫(kù)容量為7.5×105 CFU，基本符合酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求。
　　綜上，本課題成功構(gòu)建了符合酵母雙雜交篩選