柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及鈣依賴蛋白激酶3相互作用蛋白的篩選.pdf

1、近年來，由于抗球蟲藥的大量使用，球蟲耐藥性的產(chǎn)生給球蟲病的防治帶來極大的挑戰(zhàn)，球蟲疫苗的研究以及新的藥物靶標(biāo)的篩選已迫在眉睫。鈣依賴蛋白激酶(Calcium dependent proteinkinases，CDPKs)作為多基因編碼的大家族中的成員，通過Ca2+信號通路向下游傳遞磷酸化信號而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，從而使相關(guān)蛋白發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)室前期對EtCDPK3基因特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明EtCDPK3蛋白在球蟲子孢子階段高表達(dá)，在蟲體

2、入侵和逸出宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮一定的作用。為了篩選EtCDPK3的作用底物，本研究構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，以EtCDPK3為誘餌構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK3，對子孢子cDNA文庫進(jìn)行篩選，并對篩選陽性克隆的EST序列進(jìn)行Blast比對和生物信息學(xué)分析，隨機(jī)挑選三個(gè)陽性克隆EST序列，對其進(jìn)行基因克隆、構(gòu)建真核重組質(zhì)粒以及與EtCDPK3相互作用關(guān)系的驗(yàn)證。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交

3、cDNA文庫的構(gòu)建
　　提取純化的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA，經(jīng)MMLV-RT反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，利用LD-PCR擴(kuò)增合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，dscDNA經(jīng)純化柱CHROMA SPINT+TE-400Columns純化剔除小于200 bp的片段。將純化后ds cDNA、pGADT7-Rec及CarrierDNA共轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187中，dscDNA與pGADT7-Rec以同源重組的方式在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行連接

4、，經(jīng)過缺陷性培養(yǎng)基(SD/-Leu)篩選得到子孢子酵母雙雜交cDNA文庫。結(jié)果顯示，構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的轉(zhuǎn)化率為4.33×105/μg pGADT7-Rec，文庫滴度為3.62×107 cfu/mL，隨機(jī)挑取32個(gè)單克隆進(jìn)行PCR檢測，插入片段的大小在200 bp～2000 bp之間，重組率為93.75％，并以該文庫作為模板，用柔嫩艾美耳球蟲5對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了這5個(gè)基因片段。結(jié)果表明成功構(gòu)

5、建了柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，為進(jìn)一步篩選和研究球蟲入侵互作蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　2.誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK3的構(gòu)建及互作蛋白的篩選
　　根據(jù)GeneBank上EtCDPK3的基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆獲得了含EtCDPK3ORF的基因片段。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ對EtCDPK3和pGBKT7空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將回收的雙酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TOP10)，經(jīng)測序及雙酶

6、切驗(yàn)證，成功構(gòu)建了誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK3。將其轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，并對該菌株的自轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞毒性以及蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明含有誘餌重組質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌株沒有自激活活性，誘餌質(zhì)粒對酵母細(xì)胞不存在細(xì)胞毒性，而且誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK3可以在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)，因此，構(gòu)建的誘餌重組質(zhì)?？捎糜诤Y選柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫。將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDP

7、K3的Y2HGold誘餌菌株與構(gòu)建的子孢子酵母雙雜交cDNA文庫進(jìn)行雙雜交，融合好的混懸液均勻涂布在高度缺陷性固體培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上，再將平板上的單克隆轉(zhuǎn)移到含SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，重復(fù)兩次，生長良好的藍(lán)斑克隆即為陽性克隆。陽性克隆經(jīng)過質(zhì)粒提取、測序結(jié)果分析，去除重復(fù)的基因序列，最終篩選到11個(gè)陽性質(zhì)粒。
　　3.EtCDPK3

8、蛋白與陽性克隆蛋白互作的驗(yàn)證
　　隨機(jī)挑取3個(gè)陽性質(zhì)粒（編號:Et12、Et14、Et27）進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在高度缺陷性培養(yǎng)基上有藍(lán)色單克隆長出，推測這些陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒之間可能存在互作關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證它們的關(guān)系，我們用PCR技術(shù)擴(kuò)增了3個(gè)基因的ORF序列，并成功構(gòu)建了用于BiFC系統(tǒng)的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pBiFC-VC155-Et12、pBiFC-VC155-Et14、pBiFC-VC155-Et27，同時(shí)將EtCDP

9、K3連接到pBiFC-VN155載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBiFC-VN155-EtCDPK3，將鑒定正確的3個(gè)陽性重組質(zhì)粒分別與pBiFC-VN155-EtCDPK3共轉(zhuǎn)染到DF-1細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示除陽性對照有綠色熒光以外，陰性對照和樣品組均沒有綠色熒光存在;同時(shí)又構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-flag-Et12、 pcDNA3.1-flag-Et14、 pcDNA3.1-flag-Et27與pcDNA3.1-

10、EtCDPK3，間接免疫熒光和Western blot的結(jié)果表明重組質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞中能夠成功表達(dá)。經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明Flag標(biāo)簽單抗可以沉淀Et12、Et14、Et27表達(dá)的蛋白，但是不能沉淀EtCDPK3表達(dá)的蛋白。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Et12、Et14、Et27與EtCDPK3可能不存在相互作用關(guān)系。
　　4.EtCHP12功能特性的初步研究
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，EtCHP12基因的ORF為1656 b

11、p，編碼551個(gè)氨基酸，為柔嫩艾美耳球蟲保守未知蛋白，為了進(jìn)一步驗(yàn)證EtCHP12的功能，PCR擴(kuò)增了EtCHP12基因的ORF全長，連接到原核表達(dá)載體pET-28a成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EtCHP12，并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，獲得可溶性的重組蛋白。將純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗血清。體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的抗rEtCHP12多抗作用子孢子后，與正常兔血清IgG組相比子孢子入侵DF-1細(xì)胞