18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選.pdf

1、日本血吸蟲病(Schistosomiasis japonica)是我國一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。在民國流行的血吸蟲病主要是由日本血吸蟲病中國大陸株引起。發(fā)育成熟的雌蟲產(chǎn)生的大量蟲卵是引起日本血吸蟲病很多病理變化的主要因為,另外,排出的蟲卵也是該病發(fā)生的傳染源。如果將已配對的雌蟲和雄蟲分離,則雌蟲將停止產(chǎn)卵并且退化至一種未發(fā)育完全的狀態(tài),如果重新將其進行配對,則其仍能夠繼續(xù)發(fā)育成熟。抱雌溝蛋白(SjGCP:Schistosoma j

2、aponicumgynaecophoral canal protein)存在于成蟲表面尤其是雄蟲表面且只局限于在配對的直接作用部位-抱雌溝進行表達。有趣的是,抱雌溝蛋白的轉(zhuǎn)錄表達在雌雄蟲配對的同時達到高峰。這表明,抱雌溝蛋白在雌雄蟲的相互作用和刺激雌蟲發(fā)育成熟中發(fā)揮著潛在的作用。因此,對抱雌溝蛋白的深入研究對揭露血吸蟲成熟的作用機理顯得格外重要?；谶@個目的,我們構(gòu)建了18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA文庫并且用抱雌溝蛋白進行初步篩選

3、。
　　 18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建:選取日本血吸蟲18日齡蟲體,用Trizol法提取蟲體總RNA,以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA,再以5’amplimer和3’amplimer為引物進行LD-PCR擴增,從而得到雙鏈cDNA。將雙鏈cDNA用CHROMA SPINTE-400柱純化后,用酵母雜交(Yeast mating)方法將其與PGADT7-Rec轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母細胞AH109,二者在

4、酵母細胞中同源組成環(huán)形的有復(fù)制活性的cDNA文庫質(zhì)粒,收集缺亮氨酸(SD/-Leu)培養(yǎng)板上所有克隆,即為18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA文庫菌。轉(zhuǎn)化子細胞密度大于2×107cells/mL,庫容量為2.5x106 pfu/mL,插入的雙鏈cDNA片段的長度在0.25～2.0kb之間,文庫重組比率為99％,該文庫具有良好的代表性。6對特異性引物均能從文庫中釣取到日本血吸蟲成蟲相關(guān)基因。本試驗利用酵母雙雜交技術(shù)成功構(gòu)建了日本血吸蟲18

5、日齡成蟲的cDNA文庫。
　　 應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)的抱雌溝蛋白融合質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證:將編碼抱雌溝蛋白的基因的完整的開放閱讀框作為靶蛋白基因克隆至pGBKT7質(zhì)粒去構(gòu)建重組載體pGBKT7-SjGCP,將pGBKT7-SjGCP轉(zhuǎn)至酵母Y187株的感受態(tài)細胞內(nèi)。自轉(zhuǎn)錄活性檢測、蛋白表達和毒性檢測結(jié)果顯示SjGCP靶蛋白適用于酵母雙雜交系統(tǒng)。
　　 抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選:用酵母雜交(Yeast Mating)的方法

6、對日本血吸蟲18日齡酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選,對所長出的陽性克隆(藍斑)用反復(fù)傳代的方法進行篩選,我們得到了330個克隆。對隨機挑選出來的5個克隆提取酵母質(zhì)粒,并用電轉(zhuǎn)化的方法將其分別轉(zhuǎn)至大腸桿菌DHSa株后進行測序分析。我們得到了5個日本血吸蟲的EST序列:SJCHGC0566829、SJCHGC09129、SJCHGC00694、SJCHGC0607和SJCHGC05265,其分別表達日本血吸蟲的twinfilin蛋白基因、c