18日齡日本血吸蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis japonica)是我國(guó)一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病。在民國(guó)流行的血吸蟲(chóng)病主要是由日本血吸蟲(chóng)病中國(guó)大陸株引起。發(fā)育成熟的雌蟲(chóng)產(chǎn)生的大量蟲(chóng)卵是引起日本血吸蟲(chóng)病很多病理變化的主要因?yàn)?另外,排出的蟲(chóng)卵也是該病發(fā)生的傳染源。如果將已配對(duì)的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)分離,則雌蟲(chóng)將停止產(chǎn)卵并且退化至一種未發(fā)育完全的狀態(tài),如果重新將其進(jìn)行配對(duì),則其仍能夠繼續(xù)發(fā)育成熟。抱雌溝蛋白(SjGCP:Schistosoma j

2、aponicumgynaecophoral canal protein)存在于成蟲(chóng)表面尤其是雄蟲(chóng)表面且只局限于在配對(duì)的直接作用部位-抱雌溝進(jìn)行表達(dá)。有趣的是,抱雌溝蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在雌雄蟲(chóng)配對(duì)的同時(shí)達(dá)到高峰。這表明,抱雌溝蛋白在雌雄蟲(chóng)的相互作用和刺激雌蟲(chóng)發(fā)育成熟中發(fā)揮著潛在的作用。因此,對(duì)抱雌溝蛋白的深入研究對(duì)揭露血吸蟲(chóng)成熟的作用機(jī)理顯得格外重要?；谶@個(gè)目的,我們構(gòu)建了18日齡日本血吸蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)并且用抱雌溝蛋白進(jìn)行初步篩選

3、。
　　 18日齡日本血吸蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建:選取日本血吸蟲(chóng)18日齡蟲(chóng)體,用Trizol法提取蟲(chóng)體總RNA,以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA,再以5’amplimer和3’amplimer為引物進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增,從而得到雙鏈cDNA。將雙鏈cDNA用CHROMA SPINTE-400柱純化后,用酵母雜交(Yeast mating)方法將其與PGADT7-Rec轉(zhuǎn)化至感受態(tài)酵母細(xì)胞AH109,二者在

4、酵母細(xì)胞中同源組成環(huán)形的有復(fù)制活性的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒,收集缺亮氨酸(SD/-Leu)培養(yǎng)板上所有克隆,即為18日齡日本血吸蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)菌。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞密度大于2×107cells/mL,庫(kù)容量為2.5x106 pfu/mL,插入的雙鏈cDNA片段的長(zhǎng)度在0.25～2.0kb之間,文庫(kù)重組比率為99％,該文庫(kù)具有良好的代表性。6對(duì)特異性引物均能從文庫(kù)中釣取到日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)相關(guān)基因。本試驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)成功構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng)18

5、日齡成蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)。
　　 應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)的抱雌溝蛋白融合質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證:將編碼抱雌溝蛋白的基因的完整的開(kāi)放閱讀框作為靶蛋白基因克隆至pGBKT7質(zhì)粒去構(gòu)建重組載體pGBKT7-SjGCP,將pGBKT7-SjGCP轉(zhuǎn)至酵母Y187株的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。自轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)、蛋白表達(dá)和毒性檢測(cè)結(jié)果顯示SjGCP靶蛋白適用于酵母雙雜交系統(tǒng)。
　　 抱雌溝蛋白相互作用因子的篩選:用酵母雜交(Yeast Mating)的方法

6、對(duì)日本血吸蟲(chóng)18日齡酵母雙雜交cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,對(duì)所長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆(藍(lán)斑)用反復(fù)傳代的方法進(jìn)行篩選,我們得到了330個(gè)克隆。對(duì)隨機(jī)挑選出來(lái)的5個(gè)克隆提取酵母質(zhì)粒,并用電轉(zhuǎn)化的方法將其分別轉(zhuǎn)至大腸桿菌DHSa株后進(jìn)行測(cè)序分析。我們得到了5個(gè)日本血吸蟲(chóng)的EST序列:SJCHGC0566829、SJCHGC09129、SJCHGC00694、SJCHGC0607和SJCHGC05265,其分別表達(dá)日本血吸蟲(chóng)的twinfilin蛋白基因、c