日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用分子的鑒定及兩個相關(guān)蛋白的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患病。目前可以通過藥物對感染血吸蟲病的個體進行治療,但是藥物治療不能很好地解決重復(fù)感染的問題,也不能有效的預(yù)防血吸蟲病的發(fā)生,所以血吸蟲病疫苗的研發(fā)顯得尤為重要。在血吸蟲生長發(fā)育過程中雌雄蟲合抱尤為關(guān)鍵,血吸蟲抱雌溝蛋白是一種可在雌雄蟲合抱過程中進行傳遞并影響雌雄蟲合抱的物質(zhì)。因此,血吸蟲抱雌溝蛋白及與其相互作用蛋白的研究對血吸蟲生長發(fā)育機制的探索及新疫苗的開發(fā)具有重要意義。
　　 本論文

2、研究工作首先分析了日本血吸蟲抱雌溝蛋白功能,然后在本實驗室前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出多個與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用陽性克隆的基礎(chǔ)上,通過回復(fù)雜交實驗驗證了部分克隆與抱雌溝蛋白間的相互作用,并從中挑選兩個基因進行了進一步的研究。論文具體研究工作如下:
　　 一、抱雌溝蛋白功能分析及其相互作用蛋白的鑒定
　　 利用RNAi和表達譜芯片技術(shù)對抱雌溝蛋白功能進行分析,結(jié)果顯示抱雌溝蛋白可能是一種細胞粘附蛋白,對血吸蟲的生長

3、發(fā)育及代謝等生物學(xué)進程產(chǎn)生重要影響。另外,本實驗室前期研究成功構(gòu)建了18日齡日本血吸蟲酵母雙雜交cDNA預(yù)雜交文庫,并利用該技術(shù)篩選到與日本血吸蟲抱雌溝蛋白相互作用的383個陽性克隆,對序列分析整合后得到45條不同的基因序列。為了排除假陽性,對篩選到的基因進行了酵母體系相互作用驗證,結(jié)果得到16個與抱雌溝蛋白相互作用的基因,并排除了4個假陽性克隆,相互作用分子中12個為已在GenBank登陸的基因,另外4個為未知基因。
　　 二

4、、SjGALE基因的研究
　　 首次克隆并表達了SjGALE基因,利用real-time RT-PCR和Western blot考查了該基因在日本血吸蟲不同時期的表達情況,結(jié)果顯示該基因在日本血吸蟲的各個時期均有表達,23d成蟲體內(nèi)表達水平最高。免疫組化實驗表明該蛋白主要分布于日本血吸蟲體被,少量存在于蟲體內(nèi)部組織。為了考查SjGALE的免疫保護效果,利用rSjGALE免疫小鼠后進行攻擊感染,結(jié)果減蟲率和減卵率分別為34％和49

5、％,每只雌蟲對肝臟蟲卵負(fù)荷貢獻率降低63％,并且產(chǎn)生了高水平的特異性抗體。IgG抗體亞型分析發(fā)現(xiàn),rSjGALE免疫小鼠后的30-90天內(nèi)IgG1／IgG2a的數(shù)值逐漸降低,說明rSjGALE免疫小鼠后引起Th1型免疫反應(yīng)。進一步的細胞因子實驗分析發(fā)現(xiàn),免疫小鼠的脾細胞經(jīng)rSjGALE蛋白刺激后IFN-γ,TNF-α和IL-10細胞因子含量較對照組顯著升高,IL-4的水平?jīng)]有明顯變化,進一步證實rSjGALE介導(dǎo)了Th1保護性免疫反應(yīng)。

6、
　　 三、日本血吸蟲新基因Si34.9的研究
　　 Sj34.9是經(jīng)驗證與日本血吸蟲抱雌溝蛋白具有相互作用的分子,且該分子在之前的工作中從未被報道。為深入研究該分子的生物學(xué)功能,本研究利用酵母雙雜交所得該陽性克隆的已知部分序列,利用RACE技術(shù)擴增得到其全長cDNA.其完整cDNA序列1514 bp,含有完整的ORF966 bp,編碼321個氨基酸,理論分子量為34.9 kDa,等電點為9.38。經(jīng)查詢表明該基因為日本

7、血吸蟲新基因,將其cDNA序列上傳GenBank,命名為sj34.9,登陸號為:JF907494。利用Real-time PCR分析了Sj34.9基因在血吸蟲不同時期的表達情況,結(jié)果顯示該基因在血吸蟲各個時期幾乎穩(wěn)定表達,且雌蟲體內(nèi)該基因的轉(zhuǎn)錄水平高于雄蟲。利用rSj34.9蛋白免疫小鼠后攻擊感染日本血吸蟲尾蚴,通過蟲卵數(shù)的統(tǒng)計考查該重組蛋白的免疫保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rSj34.9蛋白不具有減蟲作用,減卵率為28.9％。利用RNAi技術(shù)成

8、功對Sj34.9基因在血吸蟲體內(nèi)的表達進行了干擾,利用血吸蟲的寡聚核苷酸表達譜芯片分析了Sj34.9基因表達沉默后血吸蟲基因的表達情況。結(jié)果顯示,RNAi組與對照組相比,顯著差異表達的基因共378個,其中上調(diào)基因202個,下調(diào)基因176個；通路分析顯示,差異基因主要與物質(zhì)代謝,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及信號分子間相互作用有關(guān)；基因本體論(GO)分類結(jié)果顯示,多數(shù)基因與分子間結(jié)合,膜的構(gòu)成,細胞過程和機體的生長發(fā)育及代謝相關(guān)。因而推測Sj34.9基因可能