大豆隱花色素基因的酵母雙雜交分析.pdf

1、隱花色素(cryptochrome)是吸收藍(lán)光和近紫外光而調(diào)節(jié)植物形態(tài)、新陳代謝變化以及向光反應(yīng)的一類光敏受體。隱花色素廣泛存在于生物界中，研究證明許多植物的隱花色素是分子量為70-80kD的蛋白質(zhì)，有兩個可識別區(qū)域：一個是與光解酶有同源序列的N端PHR(photolyaserelated)，但不具有光解酶的DNA修復(fù)活性；另一個是光解酶不具有的C端延伸區(qū)，C端是蛋白-蛋白結(jié)合區(qū)，具有保守性，也是藍(lán)光信號得以向下游傳遞的延伸區(qū)域。藍(lán)光信

2、號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及隱花色素與其他蛋白質(zhì)間直接或間接的相互作用。目前，許多植物的隱花色素基因已相繼被分離和初步鑒定。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所613室克隆了大豆兩個隱花色素基因并對其功能作了初步的分析。 1.酵母雙雜交是體內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。為進一步研究這兩個基因的功能及下游信號傳導(dǎo)機制，本試驗對這兩個基因作了酵母雙雜交分析。首先用PCR及酶切、連接的方法構(gòu)建了兩個基因的N端、C端及全長的酵母雙雜交誘餌載體：pGBKT7-CR

3、Y1N、pGBKT7-CRY1C、pGBKT7-CRY1Q、pGBKT7-CRY2N、pGBKT7-CRY2C、pGBKT7-CRY2Q。分別與空的AD載體pGADT7組合轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109進行自激活檢測，結(jié)果表明只有pGBKT7-CRY2N+ppGADT7能激活報告基因的表達，因此重組質(zhì)粒pGBKT7-CRY2N不能用于酵母雙雜交分析。 2.用pGBKT7-CRY1C作為誘餌，篩選了大豆酵母雙雜cDNA文庫。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法

4、將誘餌和文庫質(zhì)粒先后轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109后，經(jīng)SD/-Leu-Trp培養(yǎng)基擴增，然后鑒定轉(zhuǎn)化子對HIS3、ADE2、lacZ三個報告基因的激活情況，初步獲得了17個能同時激活三個報告基因的陽性克隆。對陽性克隆進行了PCR和測序分析，序列分析的結(jié)果表明其中5個克隆含有正確的讀碼框，同源性分析表明其中4個是與光系統(tǒng)中基因同源的序列。 3.將來源于大腸桿菌這五個克隆的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CRY1C組合，重新轉(zhuǎn)回酵母細(xì)胞AH1