大豆隱花色素基因的酵母雙雜交分析.pdf

1、隱花色素(cryptochrome)是吸收藍(lán)光和近紫外光而調(diào)節(jié)植物形態(tài)、新陳代謝變化以及向光反應(yīng)的一類光敏受體。隱花色素廣泛存在于生物界中，研究證明許多植物的隱花色素是分子量為70-80kD的蛋白質(zhì)，有兩個(gè)可識(shí)別區(qū)域：一個(gè)是與光解酶有同源序列的N端PHR(photolyaserelated)，但不具有光解酶的DNA修復(fù)活性；另一個(gè)是光解酶不具有的C端延伸區(qū)，C端是蛋白-蛋白結(jié)合區(qū)，具有保守性，也是藍(lán)光信號(hào)得以向下游傳遞的延伸區(qū)域。藍(lán)光信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及隱花色素與其他蛋白質(zhì)間直接或間接的相互作用。目前，許多植物的隱花色素基因已相繼被分離和初步鑒定。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所613室克隆了大豆兩個(gè)隱花色素基因并對(duì)其功能作了初步的分析。 1.酵母雙雜交是體內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因的功能及下游信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)這兩個(gè)基因作了酵母雙雜交分析。首先用PCR及酶切、連接的方法構(gòu)建了兩個(gè)基因的N端、C端及全長(zhǎng)的酵母雙雜交誘餌載體：pGBKT7-CR

3、Y1N、pGBKT7-CRY1C、pGBKT7-CRY1Q、pGBKT7-CRY2N、pGBKT7-CRY2C、pGBKT7-CRY2Q。分別與空的AD載體pGADT7組合轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109進(jìn)行自激活檢測(cè)，結(jié)果表明只有pGBKT7-CRY2N+ppGADT7能激活報(bào)告基因的表達(dá)，因此重組質(zhì)粒pGBKT7-CRY2N不能用于酵母雙雜交分析。 2.用pGBKT7-CRY1C作為誘餌，篩選了大豆酵母雙雜cDNA文庫(kù)。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法

4、將誘餌和文庫(kù)質(zhì)粒先后轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109后，經(jīng)SD/-Leu-Trp培養(yǎng)基擴(kuò)增，然后鑒定轉(zhuǎn)化子對(duì)HIS3、ADE2、lacZ三個(gè)報(bào)告基因的激活情況，初步獲得了17個(gè)能同時(shí)激活三個(gè)報(bào)告基因的陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了PCR和測(cè)序分析，序列分析的結(jié)果表明其中5個(gè)克隆含有正確的讀碼框，同源性分析表明其中4個(gè)是與光系統(tǒng)中基因同源的序列。 3.將來(lái)源于大腸桿菌這五個(gè)克隆的質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CRY1C組合，重新轉(zhuǎn)回酵母細(xì)胞AH1