日本腦炎病毒核衣殼蛋白酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建及自激活檢測.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建JEVC蛋白編碼基因的酵母雙雜交誘餌載體,并檢測其蛋白表達(dá)產(chǎn)物對酵母細(xì)胞有無毒性及對酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因有無自激活效應(yīng),為篩選及驗(yàn)證JEVC蛋白相互作用相關(guān)蛋白奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、質(zhì)粒、載體、菌株、細(xì)胞
　　 質(zhì)粒pMD-JC由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存,所選表達(dá)載體pMD19-Tsimple購自TaKaRa公司;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliC

2、ompetentCellsJM109購自TaKaRa公司,用于重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化;酵母菌Y2HGold及載體pGBKT7、pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam購自Clontech公司,用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。
　　 2、主要試劑
　　 PCR用DNA聚合酶(CodeNo.DR010S)、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒(CodeNo.DV801A)、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(CodeNo.DV805

3、A)、酶促反應(yīng)DNA片斷純化試劑盒(CodeNo.DV807A)、DNAT4連接酶(CodeNo.DR6023)、限制性內(nèi)切酶EcoRI/BamHI等均購自TaKaRa公司,用于重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定;氨芐青霉素、卡那霉素購自Sigma公司,瓊脂糖購自TaKaRa公司,用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及電泳分析;酵母培養(yǎng)基、各種氨基酸缺陷培養(yǎng)基、X-α-gal、金擔(dān)子素、50%聚乙二醇3350、10x醋酸鋰等購自Clontech公司,用于酵母菌Y2HGold感

4、受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞及酵母氨基酸缺陷篩選;酵母總蛋白提取試劑盒(CodeNo.D6023)購自TaKaRa公司,SDS-PAGE上樣緩沖液、預(yù)染蛋白Marker、PVDF膜購自碧云天公司,一抗BD-mAb購自Clontcch公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記-羊抗鼠IgG購自Santa公司,GAPDH內(nèi)參抗體購自Earthox公司,用于Western-blotting分析。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、誘餌質(zhì)粒

5、pGBKT7-JC構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定。
　　 2、PEG/LiAC法將質(zhì)粒pGBKT7-JC與載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞。
　　 3、經(jīng)酵母氨基酸缺陷培養(yǎng)及表現(xiàn)型篩選檢測誘餌蛋白對酵母細(xì)胞毒性。
　　 4、經(jīng)酵母氨基酸缺陷培養(yǎng)及表現(xiàn)型篩選檢測誘餌蛋白酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因自激活效應(yīng)。
　　 5、Western-blotting法檢測誘餌蛋白BD-JC的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6、:
　　 1、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-JC構(gòu)建及鑒定
　　 重組質(zhì)粒pGBKT7-JC經(jīng)EcoRI/BamHI酶切后電泳分析,得到381bp與7.3kb大小的兩個(gè)片段,與預(yù)期一致;測序分析JEVC蛋白編碼基因與發(fā)表的序列完全相符,構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒命名為pGBKT7-JC。
　　 2、質(zhì)粒pGBKT7-JC與載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞
　　 PEG/LiAC法將已鑒定正確的pG

7、BKT7-JC與空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞,涂布于SD/-Trp進(jìn)行菌落篩選,30℃溫箱孵育3～5天后兩組缺陷培養(yǎng)基上均可見大小均勻陽性菌落生長。
　　 3、誘餌蛋白毒性檢測
　　 觀察發(fā)現(xiàn)SD/-Trp氨基酸缺陷培養(yǎng)基上已轉(zhuǎn)化pGBKT7-JC與pGBKT7的酵母菌落數(shù)、菌落大小、分布無明顯差異;將轉(zhuǎn)化有pGBKT7-JC與pGBKT7酵母菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中振蕩過夜測得O

8、D600值分別為0.8643和0.8706,均＞0.8。
　　 4、誘餌蛋白自激活檢測
　　 已轉(zhuǎn)化pGBKT7-JC的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal缺陷培養(yǎng)基上可見陽性菌落生長,但菌落顏色未變藍(lán);而已轉(zhuǎn)化pGBKT7-JC的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/AbA缺陷培養(yǎng)基上未見菌落生長。
　　 5、Western-blotting法檢測誘餌蛋白BD-JC的表達(dá)
　　 Western-bl