大豆結(jié)瘤中miRNA的篩選及功能研究.pdf

1、大豆是世界上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物,大豆和微生物的互作誘導(dǎo)共生器官根瘤的產(chǎn)生,根瘤是固氮作用發(fā)生的組織,對(duì)大豆的生長發(fā)育提供重要的營養(yǎng)元素。
　　 大豆根瘤形成的研究已經(jīng)進(jìn)入了分子生物學(xué)領(lǐng)域,越來越多的mi:RNA在豆科植物中被發(fā)現(xiàn),它們對(duì)豆類植物的生長發(fā)育均起著重要作用。在大豆中與根瘤相關(guān)的microRNA僅有極少數(shù)報(bào)道,研究新發(fā)現(xiàn)的miRNA在結(jié)瘤過程中的作用,明確這些miRNA的功能就顯得尤為重要。
　　 本研究

2、從本實(shí)驗(yàn)室前人工作中已經(jīng)整合得到的35個(gè)新發(fā)現(xiàn)的microRNA中,分析和選擇在數(shù)據(jù)庫中至少有10個(gè)重復(fù)的microRNA,得到17個(gè)microRNA被隨后用于本研究。
　　 本試驗(yàn)用根瘤菌USDA110侵染栽培品種Williams82后于不同時(shí)間點(diǎn),通過Northern雜交的方法,對(duì)17個(gè)新發(fā)現(xiàn)的microRNA進(jìn)行檢測(cè),獲得6個(gè)有表型的microRNA,這6個(gè)microRNA分別是miR482、miR1507、miR1511

3、、miR1512、miR1515和miR1521,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)表型各不相同,說明不同的新發(fā)現(xiàn)的miRNA在根瘤發(fā)育的不同階段具有不同的表達(dá)量,啟示這些新發(fā)現(xiàn)的miRNA在根瘤發(fā)育中不同時(shí)間或許起著不同的調(diào)控作用。隨后用生物信息學(xué)方法在基因組數(shù)據(jù)庫中對(duì)它們進(jìn)行基因組定位,發(fā)現(xiàn)它們分布在1號(hào)、2號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、17號(hào)和18號(hào)染色體上,表明它們?cè)诖蠖共煌M織中或許起著不同的調(diào)控作用。經(jīng)過Northern雜交檢測(cè)這6個(gè)miRNA在W

4、illiams82的根、莖、葉、花、嫩莢、R5和R6的種子共7個(gè)組織中的表型,發(fā)現(xiàn)miR1512僅在根中表達(dá),而其它5個(gè)miRNA在不同組織中均有表達(dá),但是表達(dá)量和表達(dá)趨勢(shì)各不相同。進(jìn)一步用生物信息學(xué)軟件篩選出這6個(gè)miRNA的10個(gè)候選miRNA前體,再用RNAmFold對(duì)這些前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)大豆中由根瘤菌誘導(dǎo)的miRNA前體在結(jié)構(gòu)和長度上則存在多樣性,它們介于95～145個(gè)堿基之間,表明這些miRNA在基因表達(dá)的調(diào)控中

5、起到的作用也不盡相同；miRNA成熟序列在前體中位置上也具有多樣性,有3個(gè)miRNA定位在它們前體的3’端,有2個(gè)miRNA定位在它們前體的5’端,10個(gè)前體的最小折疊自由能介于-36.6～-63.8,具有較低的自由能,表明了這些前體預(yù)測(cè)的正確性。
　　 對(duì)上述6個(gè)經(jīng)W82篩選出來的新發(fā)現(xiàn)的miRNA在品種Bragg中的不同時(shí)間點(diǎn)即0h,6h,12h,2d,6d進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的表型和其在W82中相似。隨

6、后用Bragg的2個(gè)大豆突變體檢測(cè)這些miRNA的表型,發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌蛔凅w中的表型不同,根瘤菌B.japonicum誘導(dǎo),miR482和miR1521或許并不受結(jié)瘤因子受體基因NFRl和大豆根瘤自動(dòng)調(diào)控接受酶GmNARK1信號(hào)調(diào)控,但miR1511和miR1512受到調(diào)控；miR1515僅受GmNARK1調(diào)控,而不受NFR1調(diào)控。
　　 為了進(jìn)一步研究上述6個(gè)miRNA的功能,我們對(duì)其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過生物信息學(xué)及在線大豆

7、基因數(shù)據(jù)庫,從1505條序列中篩選出來19條序列作為候選靶基因。通過Reverse Transcript-PCR的方法,對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因在W82不同組織、不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),將得到的至少在根中表達(dá)的8個(gè)靶基因用根瘤菌侵染突變體后不同時(shí)間點(diǎn)的根進(jìn)行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR1521和其靶基因Gm0022x00379的表型十分匹配。并通過5’-RACE的方法對(duì)miR482,miR1512和miR1515在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,最后miR

8、482和miR1515在預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)處同靶基因結(jié)合,但miR1512并未在預(yù)期的結(jié)合位點(diǎn)與靶基因結(jié)合,這可能是由于有其它機(jī)制的調(diào)控作用。
　　 在篩選出來的6個(gè)miRNA中,有4個(gè)miRNA的靶基因具有良好的表型,即miR482、miR1507、miR1512和miR1515,它們被用于研究在根瘤發(fā)育過程中的作用。構(gòu)建了兩套gateway過量表達(dá)載體,分別由組成型啟動(dòng)子CsVMV和對(duì)僅根瘤菌應(yīng)答的大豆ENOD40啟動(dòng)子啟動(dòng)。通過

9、毛狀根系統(tǒng)生成的轉(zhuǎn)基因根,用Northern雜交確證miRNA被過量表達(dá)。借助毛狀根系統(tǒng),設(shè)計(jì)三次根瘤統(tǒng)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CsVMV載體系統(tǒng)中,miR482的根瘤數(shù)目顯著增多,約是對(duì)照的2倍；miR1515的根瘤數(shù)目約是對(duì)照的1.5倍,差異顯著(P<0.05),這些結(jié)果表明miR482和miR1515在大豆根中對(duì)根瘤形成過程起到一定調(diào)控作用。而過量表達(dá)的miR1507和miR1512并未引起根瘤數(shù)目的顯著變化。ENOD40載體系統(tǒng)中,mi