肺癌miRNA表達(dá)譜的篩選及定量驗(yàn)證方法的研究.pdf

1、肺癌是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡最主要的癌癥之一。研究肺癌與相關(guān)生物分子的關(guān)系對于深入探討腫瘤的診治及發(fā)生發(fā)展意義重大。近年來microRNA(miRNA)作為一類內(nèi)源性小的非編碼的調(diào)控RNA備受關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)表明miRNA的表達(dá)調(diào)控與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，諸多與肺癌相關(guān)的miRNA的異常表達(dá)也被大量的研究所證實(shí)，該特異性miRNA最直接的研究來源則是肺癌組織，而且不同類型的肺癌組織中miRNA的表達(dá)也不盡相同。然而miRNA作為重要的調(diào)

2、控分子如何發(fā)揮作用的，以及其在腫瘤組織，癌旁組織和正常組織中表達(dá)水平的差異情況和變化規(guī)律如何，目前相關(guān)的報道還很少。
　　在眾多miRNA的檢測分析方法當(dāng)中，northern blotting、實(shí)時熒光定量PCR等傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)以及基因芯片和新一代高通量測序等并行檢測技術(shù)都已經(jīng)被大量的應(yīng)用。而其中定量PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，在單個miRNA表達(dá)水平檢測，差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證分析以及進(jìn)一步功能探討中都有涉及，因此針對miR

3、NA的定量PCR檢測方法也成為當(dāng)前miRNA研究的一個重要方面。發(fā)展優(yōu)化針對miRNA的定量PCR檢測方法意義重大。
　　鑒于miRNA及其在肺癌中研究的現(xiàn)狀，本論文首先利用新一代高通量測序技術(shù)對肺癌病人癌組織，癌旁組織和正常組織進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜的篩選;隨后針對miRNA定量檢測中存在的一些問題發(fā)展了一種通用的定量PCR檢測方法，并對測序篩選出來的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證分析。本論文的主要研究內(nèi)容如下:
　　1、

4、肺癌組織miRNA表達(dá)譜的篩選:我們利用新一代高通量測序技術(shù)對肺鱗癌病人癌組織，癌旁組織和正常組織中的miRNA進(jìn)行了全基因組水平上的測序。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌癥樣本、癌旁樣本及正常樣本中分別檢測出了226，207和137種microRNAs，其中三類樣本中共表達(dá)的miRNA有132種。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示相對于正常組織而言，癌組織中發(fā)現(xiàn)有58種顯著差異表達(dá)的miRNA;而癌旁組織中有37種顯著差異表達(dá)的miRNAs。部分差異表達(dá)的miRNA在定

5、量PCR檢測中得到了驗(yàn)證。靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，大多數(shù)靶基因都參與RNA轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控、細(xì)胞周期的調(diào)控等相關(guān)過程。KEGG信號通路分析結(jié)果可以看出，絕大多數(shù)差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的靶基因均參與腫瘤相關(guān)的信號調(diào)控通路。
　　2、通用miRNA定量PCR方法的研究及應(yīng)用:該方案針對當(dāng)前miRNA定量檢測中引物探針等設(shè)計復(fù)雜、費(fèi)用較高、步驟繁瑣等問題提出并發(fā)展了一種以隨機(jī)的預(yù)腺苷酸化接頭的連接為基礎(chǔ)通用miRNA定量方法。該方案以mi