奶山羊乳腺組織乳脂代謝關(guān)鍵miRNA的篩選及功能驗證.pdf

1、羊奶中蛋白質(zhì)、維生素、鈣、礦物質(zhì)、總脂肪含量高，羊奶所含的有益脂肪酸含量（如短、中鏈脂肪酸，不飽和脂肪酸和共軛酸等）均顯著高于牛奶，羊奶中的乳脂代謝非常復雜，它受多種因素調(diào)控。MiRNA(microRNA)可通過調(diào)控其靶基因的表達影響脂肪酸代謝過程。本研究對奶山羊不同泌乳時期（泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期）乳腺組織進行miRNA篩選后，對催乳素處理的乳腺上皮細胞做進一步篩選，發(fā)現(xiàn)6個表達差異的miRNA。在此基礎上，對這些篩選出

2、來的miRNA在功能、調(diào)控關(guān)系以及分子機制方面進行深入研究。得到如下主要研究結(jié)果:
　　1.奶山羊乳腺組織miRNA表達譜分析及乳脂代謝關(guān)鍵miRNA篩選
　　研究以奶山羊泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期的乳腺組織進行miRNA表達量檢測，基于miRBase數(shù)據(jù)庫提供的793條牛的miRNA和267條羊的miRNA進行第一輪的篩選，以p值小于0.05且差異在4倍以上為標準，篩選得到156個表達差異的miRNA。隨后使用與

3、發(fā)動泌乳密切相關(guān)的因子——催乳素（2.5μg/ml）處理乳腺上皮細胞，進行第二輪篩選。發(fā)現(xiàn)miR-30e-5p，miR-15a，miR-181b，miR-148a，miR-17-5p和miR-135b這6個miRNA在催乳素處理的乳腺上皮細胞中表達差異顯著。
　　2.MiR-181b通過IRS2(Insulin receptor substrate2)抑制TAG合成并調(diào)控Hippo信號通路基因
　　在乳腺上皮細胞過表達miR

4、-181b可以抑制乳脂代謝，而抑制miR-181b可以促進乳脂代謝。熒光素酶報告試驗和Western Blot試驗證明了miR-181b的靶基因為IRS2。此外，在乳腺上皮細胞中，miR-181b可以調(diào)控Hippo信號通路中的多個作用元件，如LATS1和YAP1。簡而言之，研究發(fā)現(xiàn)miR-181b通過調(diào)控Hippo通路上的多個元件及靶向IRS2抑制脂代謝。
　　3.MiR-30e-5p和miR-15a通過靶向LRP6和YAP1基因

5、協(xié)同調(diào)控乳脂代謝
　　QRT-PCR和Western Blot試驗證明了miR-30e-5p和miR-15a分別通過靶向Yes相關(guān)蛋白(YAP1)和LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)來促進脂質(zhì)分化。其中，miR-30e-5p可以調(diào)控β-catenin基因，β-catenin進而介導YAP1的表達。在乳腺上皮細胞脂代謝中YAP1基因的mRNA和蛋白水平表達受miR-30e-5p調(diào)控。此外，在乳腺上皮細胞中過表達miR-30e-5p和m

6、iR-15a可以促進脂代謝，與之相反抑制miR-30e-5p和miR-15a可以減少脂代謝。此外，miR-30e-5p通過調(diào)控miR-15a表達水平來協(xié)同調(diào)控YAP1在乳腺上皮細胞中的乳脂代謝功能。
　　4.PRL通過甲基化修飾抑制miR-135b功能
　　QRT-PCR和Western Blot試驗證明LATS2作為miR-135b的靶基因來行使乳脂代謝功能。PRL處理乳腺上皮細胞時，對下調(diào)miR-135b的表達有一定的時

7、間和濃度梯度效果。此外，miR-135b的5'端發(fā)現(xiàn)一個CpG島，通過調(diào)控CpG島的甲基化來抑制miR-135b表達。進一步對PRL處理的乳腺上皮細胞中miR-135b的功能和作用途徑進行研究發(fā)現(xiàn)，DNMTI（DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Ⅰ）表達水平顯著提高，而miR-135b表達水平下調(diào)。此外，當miR-135b的表達受到抑制時，LATS2表達水平上調(diào)。這就導致乳腺上皮細胞中乳脂代謝水平提高，從而行使維持泌乳等功能。
　　5.MiR-14

8、8a和miR-17-5p通過PPAR GC1A和PPARA基因協(xié)同調(diào)控乳腺上皮細胞乳脂代謝
　　表達譜結(jié)果顯示miR-148a、miR-17-5p、PPARGC1A和PPARA在泌乳盛期和干奶期中表達差異顯著。熒光素酶和Western Blot試驗發(fā)現(xiàn)，PPARA（脂肪酸調(diào)控重要因子）和PAR GC1A（調(diào)控脂代謝基因）分別是miR-148a和miR-17-5p的靶基因，而miR-148a可以調(diào)控PPARA，miR-17-5p可以

9、調(diào)控PPARGC1A。過表達miR-148a和miR-17-5p促進甘油三酯(TAG，Triglyceride)的合成，而抑制miR-148a和miR-17-5p降低TAG的產(chǎn)生。重要的發(fā)現(xiàn)是miR-148a和miR-17-5p的協(xié)同作用促進了TAG的合成。即在乳腺上皮細胞中，miR-148a與miR-17-5p分別調(diào)控PPARGC1A和PA RA來協(xié)同完成TAG的合成，。
　　本研究篩選的6個miRNA及其靶基因?qū)θ橹x的影響