奶山羊乳腺脂肪酸合酶基因表達(dá)的RNA干擾研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)利用乙酰-CoA、丙二酸單酰-CoA和NADPH等催化飽和脂肪酸的合成。山羊乳腺短、中鏈脂肪酸合成受到FAS中的乙酰/丙二酸單?；D(zhuǎn)移酶(Acctyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，AT/MT)功能域的轉(zhuǎn)?；饔谜{(diào)控。通過調(diào)控FAS基因表達(dá)而改變山羊乳脂肪酸組成，是探討動(dòng)物脂肪酸合成機(jī)理的重要方法之一。 本研究通過添加不同

2、濃度的17β-雌二醇(脂肪酸合酶基因的化學(xué)抑制劑)和RNA干擾技術(shù)抑制乳腺細(xì)胞脂肪酸合酶基因的表達(dá)，對(duì)其功能進(jìn)行初步研究，為奶山羊乳腺脂肪酸合成代謝的分子機(jī)理研究提供依據(jù)。主要包括以下內(nèi)容： (1)以健康的純種西農(nóng)薩能羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，構(gòu)建奶山羊乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并對(duì)其生長特性、形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞遺傳和β-酪蛋白表達(dá)等相關(guān)特性進(jìn)行了分析和鑒定，為研究乳腺細(xì)胞的基因功能奠定了基礎(chǔ)； (2)利用MTT法、LDH酶活性測定、

3、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、氣相色譜技術(shù)和透射電子顯微鏡研究了17β-雌二醇對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖分化的影響、乳腺上皮內(nèi)脂肪酸合酶基因和脂肪酸組成含量的影響以及乳腺上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響； (3)采用化學(xué)合成siRNA、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、MTT法、LDH酶活性測定、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、Western blotting和氣相色譜技術(shù)和透射電子顯微鏡等研究了沉默脂肪酸合酶基因后山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖及分化情況、脂肪酸組成含量以及乳腺上皮細(xì)胞超微結(jié)

4、構(gòu)的影響。 主要研究結(jié)果如下： 1.用組織塊培養(yǎng)法可獲得良好的山羊乳腺細(xì)胞原代產(chǎn)物；培養(yǎng)的山羊乳腺成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶更敏感，據(jù)此可在傳代過程中將二者分離純化，獲得純細(xì)胞系；形態(tài)學(xué)觀察表明，培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；染色體分析結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常的染色體數(shù)目；通過熒光免疫細(xì)胞染色方法鑒定了培養(yǎng)的細(xì)胞能夠表達(dá)上皮細(xì)胞特異的角蛋白5和8；該細(xì)胞在用誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)，用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測到了

5、β-酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。 2.17β-雌二醇對(duì)山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖分化及其脂肪酸組成含量具有重要的調(diào)控作用，且其作用與濃度相關(guān)。25μmol/L、250μmol/L和500μmol/L的17β-雌二醇均可顯著刺激山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖，顯著提高乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸合酶基因的表達(dá)豐度，從而改變山羊乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸的組成含量，還可以改變?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；100μmol/L的17β-雌二醇可使乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH酶活力的

6、極顯著增強(qiáng)，從而引起乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的病理組織形態(tài)性損傷，顯著降低乳腺上皮細(xì)胞中脂肪酸合酶基因的表達(dá)豐度，還能誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞凋亡。 3.沉默山羊乳腺上皮細(xì)胞脂肪酸合酶基因，可抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，增加乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)損傷，改變?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞中的脂肪酸組成含量，短鏈脂肪酸的百分含量極顯著下降，中鏈脂肪酸的百分含量顯著升高，長鏈脂肪酸的百分含量略有變化，并誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，產(chǎn)生凋亡小體，同時(shí)，線粒體也出現(xiàn)腫脹，破裂現(xiàn)