酒酒球菌環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因的功能解析.pdf

1、在葡萄酒釀造過(guò)程中，主要利用酒酒球菌(Oenococcus oeni)啟動(dòng)并進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵以改善葡萄酒的風(fēng)味，而這主要得益于酒酒球菌較強(qiáng)的耐脅迫能力。在酒酒球菌適應(yīng)脅迫環(huán)境過(guò)程中，膜成分的自我調(diào)節(jié)是一個(gè)重要機(jī)制。菌體主要改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和剛性，以應(yīng)對(duì)外界的脅迫條件，維持細(xì)胞正常的生理功能。其中，細(xì)胞膜中環(huán)丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid，CFA)的合成在細(xì)菌適應(yīng)急劇變化的環(huán)境中非常重要，在酒酒球菌應(yīng)對(duì)多

2、種脅迫環(huán)境機(jī)制中都發(fā)揮著作用。研究和解析環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因(cyclopropane fatty acid synthase gene，cfa)的功能和菌株耐受性方面的相關(guān)性可以更好地探究酒酒球菌應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境進(jìn)行的膜組分變化機(jī)制;而植物乳桿菌作為啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵的另一重要菌種，本研究為進(jìn)一步促進(jìn)其啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵的廣泛實(shí)現(xiàn)提供思路和基礎(chǔ)。
　　本文首先選擇pH作為菌株篩選的脅迫因素，篩選出野生耐酸、酸敏酒酒球菌，確定耐酸

3、野生菌的生長(zhǎng)極限。然后，對(duì)耐酸、酸敏的野生菌和突變菌進(jìn)行環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。在此基礎(chǔ)上，將野生耐酸、酸敏菌株的cfa基因?qū)氪竽c桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)，并獲得純化產(chǎn)物;同時(shí)將相同的基因?qū)胫参锶闂U菌中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)重組植物乳桿菌的存活能力、降解蘋果酸能力及膜脂肪酸成分變化進(jìn)行檢測(cè)。主要完成的研究結(jié)果如下:
　　(1)在pH2.8條件下篩選實(shí)驗(yàn)室保藏的35株酒酒球菌，初步篩選出5株較耐酸菌株;在pH2.6、2.8條件下培養(yǎng)

4、5株菌，測(cè)定生存能力（即OD600值）。最終確定酒酒球菌CS-7b及ME-5b的耐酸能力最強(qiáng)，生長(zhǎng)極限為pH2.6。
　　(2)對(duì)酒酒球菌CS-7b、ME-5b及酸敏菌株SX-1b與實(shí)驗(yàn)室已有突變菌a3(耐酸)及b1(酸敏)進(jìn)行cfa基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，耐酸菌株的野生型和誘變型的序列相同，較Oenococcus oeni PSU-1發(fā)生了3處堿基突變，而酸敏菌野生型、突變型的序列則與Oenococcus oeni PSU-1一致。<

5、br>　　(3)在大腸桿菌中成功轉(zhuǎn)入SX-1b與CS-7b的cfa基因，構(gòu)建重組大腸桿菌R1、R2。確定誘導(dǎo)條件，16℃、150rpm誘導(dǎo)19h，并過(guò)Ni-NTA柱，獲得純化蛋白。
　　(4)將SX-1b與CS-7b的cfa基因在植物乳桿菌ATCC33222中表達(dá)，構(gòu)建重組載體pMG36e-cfa1和pMG36e-cfa2，并得到對(duì)應(yīng)重組菌L1和L2。對(duì)植物乳桿菌工程菌的耐酸能力進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)脅迫條件下菌體環(huán)丙烷脂肪酸含量變化。