兩株海洋微藻中△4-脂肪酸去飽和酶基因和△5-脂肪酸延長酶基因的克隆以及功能驗(yàn)證.pdf

1、球等鞭金藻(Isochrysis sphaerica)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是兩種非常重要的海洋微藻,它們是自然界中多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的初級(jí)生產(chǎn)者,在PUFAs的商業(yè)化生產(chǎn)中具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＧ虻缺藿鹪逯懈缓剂┧?Docosahexaenoic acid,DHA),三角褐指藻中二十碳五烯酸(Eicosatetraen

2、oic acid,EPA)含量很高。隨著人們對(duì)DHA和EPA等PUFAs與人體健康的積極作用研究的不斷深入,這兩種海洋微藻越來越引起人們的重視。本文以這兩種海洋微藻為研究材料,針對(duì)環(huán)境因子對(duì)球等鞭金藻生長和脂肪酸組成的影響,海洋微藻中與DHA合成相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證,基因共表達(dá)等內(nèi)容開展了研究,得到了如下一些結(jié)果:
　　 (1)測定了光照強(qiáng)度為16～58μmol／(m2·s)和15～30℃條件下球等鞭金藻的生長曲線以及脂肪酸

3、組成和含量。結(jié)果表明,在設(shè)置的光強(qiáng)范圍內(nèi),光照強(qiáng)度越強(qiáng),微藻的生長速度越快。光照強(qiáng)度對(duì)各種脂肪酸的含量影響有差異,光強(qiáng)過低和過高都不利于藻體內(nèi)總不飽和脂肪酸(Totalunsaturated fatty acids,TUFAs)的積累。當(dāng)光照強(qiáng)度為24μmol／(m2·s)時(shí)DHA的積累量最高,占總脂肪酸的11.77％。球等鞭金藻的最適生長溫度在20～25℃之間,低溫條件有利于TUFAs的積累。光強(qiáng)為24μmol／(m2·s)、溫度為2

4、0℃條件下TUFAs含量最高,達(dá)64.99％；同樣的光強(qiáng),溫度為15℃條件下DHA占總脂肪酸的12.19％。
　　 (2)利用簡并PCR、基因組步移以及RT-PCR等方法,從球等鞭金藻中克隆到△4-脂肪酸去飽和酶基因,命名為isfad4。isfad4全長1284bp,編碼427個(gè)氨基酸,推測的多肽序列具有典型的脂肪酸去飽和酶保守結(jié)構(gòu)域,包括一個(gè)細(xì)胞色素b5結(jié)合域和三個(gè)組氨酸簇。將isfad4轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(Pichia past

5、oris)GS115中,外源添加底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后分析轉(zhuǎn)化子的脂肪酸組成。結(jié)果表明isfad4在畢赤酵母中獲得了高效表達(dá),重組菌株對(duì)外源底物的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了79.8％。
　　 (3)從已知序列的未知基因片段出發(fā),通過延伸引物的方法從三角褐指藻中克隆到△5-脂肪酸延長酶基因,命名為ptfae5。ptfae5全長1110bp,編碼369個(gè)氨基酸,推測的多肽序列具有△5-脂肪酸延長酶典型的組氨酸保守結(jié)構(gòu)域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合域。將ptfae5

6、轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中,外源添加底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后分析轉(zhuǎn)化子的脂肪酸組成。結(jié)果表明,ptfae5在畢赤酵母中獲得了高效表達(dá),重組菌株對(duì)EPA轉(zhuǎn)化為二十二碳五烯酸(Docosapentaenoic acid,DPA)的轉(zhuǎn)化率為91.8％,將花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)轉(zhuǎn)化為二十二碳四烯酸(Adrenoic acid,DTA)的轉(zhuǎn)化率為81.1％。將ptfae5截短后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中,分析輔助區(qū)部分缺失對(duì)酶活的影響。結(jié)果

7、表明,N端輔助區(qū)的部分缺失不會(huì)改變△5-脂肪酸延長酶對(duì)底物的特異性,但是輔助區(qū)的缺失酶會(huì)降低該酶的活性。
　　 (4)利用isfad4和ptfae5,構(gòu)建了畢赤酵母共表達(dá)載體pAOd4e5。將pAOd4e5轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中,外源添加底物的條件下對(duì)isfad4和ptfae5進(jìn)行共表達(dá)研究。結(jié)果表明,isfad4和ptfae5在畢赤酵母中都獲得了高效表達(dá),重組菌株對(duì)EPA和DPA(n-3)的轉(zhuǎn)化效率為90.8％,對(duì)ARA和