ω-3脂肪酸去飽和酶轉(zhuǎn)基因羊的研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸(PUFAs)是細胞膜的重要組成成分，在機體的激素代謝和多種酶活性的調(diào)控中起著重要功能，一旦缺乏會引起機體生理失調(diào)而導致多種疾病，其中最具生物學功能的是ω-3PUFAs和ω-6 PUFAs。研究發(fā)現(xiàn)ω-6 PUFAs 對人體意義不大，其過量的攝入反而會危害人體健康。而ω-3 PUFAs 對人體卻有積極的意義，已被證實在預防和治療心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥等多種疾病方面發(fā)揮著重要作用。由于哺乳動物及人類不能在體內(nèi)合成ω-3 P

2、UFAs 與ω-6PUFAs，因此必須從食物中攝取來滿足需要。由于自然界中ω-6 PUFAs 含量豐富而ω-3 PUFAs 含量極少，導致人體中ω-6 PUFAs 攝入過多而ω-3 PUFAs 攝入嚴重不足，使人體中ω－6/ω－3之比高達16以上。而根據(jù)相關(guān)的研究，ω-6和ω-3 PUFAs的比例應該在1 為適宜，所以人體通常處于ω-3 PUFAs 供應不足的狀態(tài)。哺乳動物體內(nèi)維持一定量的ω-3 PUFAs 可以起到預防心血管疾病、神經(jīng)

3、退行性疾病甚至癌癥的作用，ω-6 與ω-3PUFA的平衡對機體正常生長和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用，如何增加人體ω-3 PUFAs的攝入量就成了合理利用脂肪酸的關(guān)鍵。
　　 Ω-3 脂肪酸去飽和酶基因是ω-3 PUFAs 合成的關(guān)鍵基因，它利用ω-6 PUFAs 為底物，在脂肪酸碳鏈甲基端第三個碳催化生成一個不飽和鍵，從而合成相應的ω-3 PUFAs。
　　 Fat-1基因廣泛存在于真菌、植物和一些低等動物中，它可以通過產(chǎn)生

4、出ω-3 脂肪酸脫氫酶將多不飽和脂肪酸從ω-6 轉(zhuǎn)化為ω-3 形式而發(fā)揮功能。研究人員已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因動物，如：小鼠、豬等，表達了Fat-1基因，這些研究為探索ω-3 PUFAs 功能提供了高效、準確的醫(yī)學、營養(yǎng)學動物模型。
　　 本研究采用分子生物學等技術(shù)手段，研究線蟲ω-3 脂肪酸脫氫酶基因。根據(jù)Genbank中報道的線蟲Caenorhabditis Briggsae的ω-3 脂肪酸脫氫酶sFat-1基因序列，對其密碼子進行優(yōu)化

5、，同時在sFat-1基因的上游引入增強子SP163序列，命名為SP163-sFat-1。
　　 人工合成SP163-sFat-1，然后進行克隆、測序，結(jié)果序列正確。采用分子生物學技術(shù)，將SP163-sFat-1基因克隆在真核表達載體pcDNA3.1的CMV 啟動子的下游，構(gòu)建了sFat-1基因的真核表達載體pCDNA3.1(+)-sFat-SP163。
　　 采用脂質(zhì)體介導法，將pCDNA3.1(+)-sFat-SP16

6、3 轉(zhuǎn)染CHO 細胞，同時用pCDNA3.1(+)作為對照。分別用G418 對轉(zhuǎn)染的CHO 細胞進行抗性篩選，獲得了相應的穩(wěn)定混合細胞系，陽性率達90％以上。將pCDNA3.1(+)-sFat-SP163 轉(zhuǎn)染的細胞系命名為sFat-1-CHO，將pCDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的細胞命名為pCDNA3.1-CHO。分別采用熒光定量RT-PCR 方法和Western-blot 方法，對sFat-1-CHO 與pCDNA3.1-CHO 進行檢測

7、，結(jié)果目的基因進行了轉(zhuǎn)錄，比pCDNA3.1-CHO 高105以上；同時目的基因進行了表達，sFat-1-CHO 成功表達了sFat-1蛋白，采用氣相色譜法，對sFat-1-CHO pCDNA3.1-CHO進行脂肪酸分析，結(jié)果sFat-1-CHO中ω-3 PUFAs的含量比pCDNA3.1-CHO高，且ω-6/ω-3的比例下降，表明sFat-1-CHO表達的目的蛋白具有生物學活性。
　　 該研究為進一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)促進動物自合