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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:ω-3脂肪酸脫氫酶(Fat-1基因)能夠催化ω-6 PUFAs生成ω-3 PUFAs,后者中的EP A和DHA對(duì)胎兒的大腦和視神經(jīng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用,同時(shí)在治療老年癡呆癥、心腦血管疾病、癌癥以及精神疾病等方面有著一定的效果,而ω-6 PUFAs卻與癌癥的發(fā)生關(guān)聯(lián)密切。人體內(nèi)Fat-1基因的缺乏以及飲食中ω-3 PUFAs分布不均勻,導(dǎo)致體內(nèi)ω-6 PUFAs嚴(yán)重堆積,使得ω-6/ω-3的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1:1的理想狀態(tài),因此必須通
2、過合理膳食來補(bǔ)充人體對(duì)ω-3 PUFAs的需求。植物中含有的α亞麻酸可以合成EPA和DHA,但合成效率極低,人類也可以通過攝食海產(chǎn)品來獲得ω-3 PUFAs,但這樣一來成本過高,二來也容易在體內(nèi)積累海洋污染物質(zhì)。本研究的目的,就是通過對(duì)來源于秀麗線蟲的Fat-1基因進(jìn)行改造,使其能夠在雞體細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá),同時(shí)有效地將ω-6轉(zhuǎn)化為ω-3,優(yōu)化ω-6/ω-3比例,在此基礎(chǔ)上,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得肉中富含ω-3 PUFAs的轉(zhuǎn)基因雞。方法:1.
3、 Fat-1基因密碼子的優(yōu)化、表達(dá)載體構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因活性分析
胰酶消化法獲得雞胚胎成纖維細(xì)胞;根據(jù)雞密碼子使用頻率,對(duì)秀麗隱桿線蟲Fat-1基因序列進(jìn)行優(yōu)化合成;將改造后的Fat-1基因(cFat-1)連接至pLL3.7表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLL3.7-cFat-1;經(jīng)PCR、酶切、序列分析等手段對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定;利用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將pLL3.7-cFat-1轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞;通過對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因
4、的RT-PCR檢測(cè)和綠色熒光觀察,分析cFat-1基因在細(xì)胞中的表達(dá);然后以氣相色譜分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的脂肪酸成分和含量。
2.轉(zhuǎn)基因雞的生成
①胚盤下腔顯微注射法:于新鮮未孵化種蛋的赤道最高處開口,暴露胚盤,胚盤中央明區(qū)注射2μL重組質(zhì)粒,保鮮膜封口,常規(guī)條件孵化;②外周血管顯微注射法:將孵化至13~15期的雞胚移入新的備用蛋殼,胚胎血管中注射外源質(zhì)粒,保鮮膜封口后小角度翻蛋孵化。
收集不同孵化時(shí)期的胚胎,
5、提取組織DNA、RNA以及脂肪酸,隨后進(jìn)行冰凍切片檢測(cè);再對(duì)陽(yáng)性個(gè)體的組織進(jìn)行PCR、RT-PCR以及氣相色譜檢測(cè)分析。
結(jié)果:重組載體經(jīng)序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后序列編碼氨基酸與Fat-1基因一致;cFat-1基因在雞成纖維細(xì)胞中高效表達(dá),成功構(gòu)建了可在雞體內(nèi)表達(dá)cFat-1基因的特異性表達(dá)載體;轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中ω-3 PUFAs的含量從2.33522增升至5.21512,而ω-6 PUFAs減低了1.3倍左右,ω-6 PUFAs/
6、ω-3 PUFAs比例從4.7降低到1.7;血管注射法獲得的轉(zhuǎn)基因雞的肝臟、胸肌、腿肌等組織的冰凍切片中檢測(cè)到熒光信號(hào),PCR、RT-PCR結(jié)果也證實(shí)了外源基因的表達(dá);肌肉脂肪酸分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體胸肌組織中ω-3 PUFAs的含量明顯升高,且ω-6 PUFAs與ω-3 PUFAs之比從對(duì)照組的5.1下降至2.2。
結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了適合在雞體內(nèi)表達(dá)的真核表達(dá)載體pLL3.7-cFat-1;轉(zhuǎn)染pLL3.7-cFat-
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