綠色巴夫藻脂肪酸去飽和酶的研究.pdf

1、【目的】 大量的研究證實(shí)，多不飽和脂肪酸對維系和調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生物學(xué)功能起重要的作用。在多不飽和脂肪酸的生物合成中，脂肪酸去飽和酶起著關(guān)鍵的催化和調(diào)控作用。本課題擬從富含多不飽和脂肪酸的海洋微藻中，運(yùn)用RACE-PCR方法快速、簡便的篩選和克隆脂肪酸去飽和酶基因，為進(jìn)一步探討多不飽和脂肪酸的生物合成，脂肪酸去飽和酶的功能、機(jī)制及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 【方法】 1.采用GC-MS技術(shù)分析6 種海洋微藻的脂肪酸含量和

2、脂肪酸組成。 2.運(yùn)用3′RACE方法，利用Oligo(dT)和基因特異性引物克隆與脂肪酸去飽和酶基因具有一定同源性的候選基因片段。 3.運(yùn)用5′RACE方法，利用克隆并測序的3′末端的候選基因片段設(shè)計(jì)引物克隆5′端序列。 4.運(yùn)用Overlap-PCR將候選基因3′端和5′端序列拼接成全長cDNA序列。 5.運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析候選基因同源性和蛋白的基本物理化學(xué)特性。 6.通過原核表

3、達(dá)系統(tǒng)分析克隆基因的表達(dá)和蛋白功能活性。 【結(jié)果】 GC-MS檢測分析結(jié)果表明，6種微藻的脂肪酸含量介于1.88-5.77％之間，其中以綠色巴夫藻的脂肪酸最高，達(dá)到干重的5.77％。綠藻綱(Chlorophyceae)的微綠球藻和小球藻以16∶0、18∶2(n-6)、18∶3(n-3)為主要的脂肪酸，而EPA、DHA可能含量因?yàn)闃O低或不含有而未能檢出；金藻綱(Chrysophyceae)的湛江等鞭金藻和綠色巴夫藻中1

4、4∶0、16∶0、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、DHA含量較高，湛江等鞭金藻DHA含量達(dá)到總脂的15.75％、綠色巴夫藻EPA、DHA的含量分別達(dá)到總脂的23.95％和4.83％；硅藻綱(Bacillariophyceae)的角毛藻和三角褐指藻中14∶0、16∶0、16∶1、EPA含量都較高，其中角毛藻EPA含量達(dá)到總脂的20.37％，三角褐指藻的EPA含量達(dá)到總脂的21.36％。通過檢測6種經(jīng)濟(jì)微藻中不飽和脂肪酸的含量和組成

5、，可篩選出富含多不飽和脂肪酸的微藻，為本實(shí)驗(yàn)下一步的完成提供條件。在分析部分微藻和高等植物中已克隆的脂肪酸去飽和酶基因序列的基礎(chǔ)上，利用已知編碼脂肪酸去飽和酶序列的相對保守片段設(shè)計(jì)引物，通過3’-RACE擴(kuò)增出了5條未知功能的基因片段，經(jīng)Blast同源性分析，其中一條可能是候選的脂肪酸去飽和酶基因，暫定名為B538。在獲知了3′末端序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)兩條距離相差100bp左右的特異性引物進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增，對擴(kuò)出的5′末端構(gòu)建克隆，

6、經(jīng)測序鑒定后，通過軟件鑒定其正確性。利用Overlap-PCR將5′末端和3′末端連成全長的cDNA序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，這一全長cDNA序列包含一個(gè)長為1161bp的ORF，編碼一條387個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中蛋白分子量為43.64Ku，等電點(diǎn)為5.795，與蓖麻的delta 9脂肪酸去飽和酶具有51％的相似度。 根據(jù)已知的蓖麻△9脂肪酸去飽和酶三維晶體結(jié)構(gòu)，通過同源模建預(yù)測B538的三級結(jié)構(gòu)及活性中心和底物結(jié)合部位。結(jié)果顯示

7、B538三級結(jié)構(gòu)的活性中心和底物結(jié)合部位除1個(gè)氨基酸不同外，其余21個(gè)氨基酸都與蓖麻的△9脂肪酸去飽和酶完全相同。由此可以推測，克隆出的基因很可能為可溶性的Aeyl-ACP△9脂肪酸去飽和酶． 通過SDS-PAGE 分析原核表達(dá)B538融合蛋白時(shí)，在60Ku處出現(xiàn)了一條明顯變粗的條帶，大小與理論值相符。通過Bandscan 分析,B538-38的表達(dá)量達(dá)到了總蛋白的36.7％，B538-78達(dá)到了28.6％，蓖麻的delta

8、9脂肪酸去飽和酶基因的蛋白表達(dá)量達(dá)到了19.9％，線蟲fat-1 脂肪酸去飽和酶沒有出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)帶。Western-blotting結(jié)果顯示帶有His標(biāo)簽的四個(gè)蛋白都得到了表達(dá)。GC-MS檢測結(jié)果顯示，綠色巴夫藻B538基因表達(dá)后導(dǎo)致的C18∶1和C18∶3的增加相對于對照空載具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的?？紤]到原核表達(dá)的融合蛋白包含一個(gè)150個(gè)氨基酸的標(biāo)簽，所以該基因的功能還需進(jìn)一步的分析。 【結(jié)論】 初步建立了一種簡便、快