黃斑藍(lán)子魚兩種脂肪酸去飽和酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）是包括人和魚類在內(nèi)的動(dòng)物體的必需脂肪酸（EFA）。海水魚的LC-PUFA合成能力大多缺乏或很弱，故其配合飼料中一般需要添加富含LC-PUFA的魚油才能滿足魚體正常生理功能對EFA的需要；魚油資源短缺且價(jià)格昂貴，這嚴(yán)重制約海水魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，迫切需要開發(fā)魚油的替代物。目前認(rèn)為，資源較豐富、價(jià)格較低且富含LC-PUFA前體（亞油酸和α-亞麻酸）的植物油是較理想的魚油替代物，但要成功解決植物油替代魚油問

2、題，有賴于魚類 LC-PUFA合成調(diào)控機(jī)制的闡明。本課題組近年來在黃斑藍(lán)子魚（Siganus canaliculatus）中首次發(fā)現(xiàn)和證明海水魚具有LC-PUFA合成能力，且已從該魚中克隆到所有LC-PUFA合成關(guān)鍵酶（包括?4 Fad、?6/?5 Fad、Elovl5和Elovl4）基因，這為系統(tǒng)深入的探討魚類LC-PUFA合成調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。為此，本論文擬從以下三個(gè)方面對黃斑藍(lán)子魚兩個(gè)脂肪酸去飽和酶（?4 Fad和?6/?5 F

3、ad）基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行較深入的研究。
　　一.黃斑藍(lán)子魚Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因啟動(dòng)子功能特性研究。利用生物信息學(xué)軟件對已克隆到的Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因的啟動(dòng)子（分別為2044 bp和1859 bp）上的功能元件進(jìn)行預(yù)測，然后對預(yù)測到的元件分別進(jìn)行點(diǎn)突變構(gòu)建突變體；利用HEK293T細(xì)胞系和螢火蟲熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)對突變體啟動(dòng)子的活性分別進(jìn)行定量分析，最終確定NF-1、SRE、NF-Y和HNF4α

4、等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件對Δ4 Fad啟動(dòng)子活力重要，而C/EBP、Sp1和PPARγ等元件對Δ6 Fad啟動(dòng)子活力重要，它們可能參與 Fad基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通過光神霉素誘導(dǎo)處理Fad啟動(dòng)子，讓Sp1蛋白與其元件的結(jié)合被抑制后，兩個(gè)Fad的啟動(dòng)子活力均受到抑制。
　　二.Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因啟動(dòng)子對LC-PUFA、Insulin應(yīng)答特性的比較研究。利用EPA誘導(dǎo)檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子上的

5、LC-PUFA應(yīng)答區(qū)分別位于-723 bp到-263 bp和-456 bp到+51 bp。利用不同PUFA（LA、ALA、ARA、EPA和DHA）誘導(dǎo)應(yīng)答區(qū)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Δ4 Fad啟動(dòng)子的活性受到ARA、EPA和DHA抑制，而LA（亞油酸）、ALA（亞麻酸）對其活性無明顯影響；Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子活性受到此五種PUFA抑制。通過EPA誘導(dǎo)應(yīng)答區(qū)功能元件發(fā)現(xiàn)，HNF1A、AP1和PPARγ在決定Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子對EPA的應(yīng)答反

6、應(yīng)中具有重要作用。通過Insulin誘導(dǎo)檢測發(fā)現(xiàn)，Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子的Insulin應(yīng)答區(qū)域位于-456 bp到+51 bp，且HNF1A、Sp1和PPARγ在決定Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子對Insulin的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；Δ4 Fad啟動(dòng)子對Insulin誘導(dǎo)不敏感。
　　三. HNF4α和PPARγ在Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能研究。為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子HNF4α和PPARγ在?4 Fad

7、及?6/?5 Fad基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，分別開展如下研究：（1）用HNF4α、PPARα和PPARγ的誘導(dǎo)劑處理轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞的Fad啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體（?4 Fad核心啟動(dòng)子含有HNF4α元件，?6/?5 Fad啟動(dòng)子含有PPARγ元件），從整體上分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，任意一種誘導(dǎo)藥物（HNF4α激動(dòng)劑Alverine、Benfluorex和抑制劑BI6015，PPARα激動(dòng)劑Wy14643和PPARγ激動(dòng)劑Troglitaz

8、one）對Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子活力的調(diào)節(jié)作用相反。（2）利用誘導(dǎo)劑處理黃斑藍(lán)子魚的原代肝細(xì)胞后，PPARα和PPARγ的激動(dòng)劑可顯著增加PPARγ的表達(dá)，降低Δ6/Δ5 Fad基因的表達(dá)，對Δ4 Fad基因的表達(dá)也有下調(diào)作用，但不顯著；PPARα激動(dòng)劑對PPARα基因的表達(dá)無影響，HNF4α的三種誘導(dǎo)劑對HNF4α、Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad基因的表達(dá)也沒有顯著影響。（3）通過構(gòu)建pcDNA3.1+HNF4α過表

9、達(dá)載體及過表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， HNF4α過表達(dá)可提高Δ4 Fad啟動(dòng)子的活力，降低Δ6/Δ5 Fad啟動(dòng)子的活力。（4）在黃斑藍(lán)子魚原代肝細(xì)胞中過表達(dá)HNF4αmRNA后，Δ6/Δ5 Fad和Δ4 Fad基因的表達(dá)水平顯著提高，但原代肝細(xì)胞的脂肪酸組成不受影響，說明HNF4α對Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad的調(diào)節(jié)作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
　　總之，本研究確定了Δ4 Fad和Δ6/Δ5 Fad基因啟動(dòng)子上重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及其PU

10、FA和Insulin的應(yīng)答區(qū)，并鑒定出Δ6/Δ5 Fad基因啟動(dòng)子上PUFA和Insulin應(yīng)答區(qū)的應(yīng)答元件。Sp1元件在決定Fad啟動(dòng)子活力、Insulin應(yīng)答方面起著重要作用。PPARγ和HNF4α分別是Fad基因表達(dá)負(fù)調(diào)控因子和正調(diào)控因子。這是首次在脊椎動(dòng)物中報(bào)道Δ4 Fad基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能特性，首次在海洋魚類中報(bào)道Δ6/Δ5 Fad基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，也是首次在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)HNF4α是Fad基因的轉(zhuǎn)錄因子。研究成果可為全面揭