抗巨細胞病毒人源化抗體的研究.pdf

1、目的:意義人類巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是Smith等在1956年首先從一名死亡嬰兒的頜下腺中分離出來的一種病毒，1964年正式命名為巨細胞病毒。它屬β亞科皰疹病毒，為雙鏈DNA病毒，直徑約180～250nm，是一種廣泛傳播的種屬特異性病毒。人類感染該病毒后多呈亞臨床感染或潛伏感染。在多數(shù)免疫功能正常個體中一般不產(chǎn)生明顯的臨床表現(xiàn)，然而卻能持續(xù)排放病毒，造成廣泛傳播。但是，巨細胞病毒對免疫低下患者、

2、育齡婦女及兒童危害極大。在免疫功能低下人群中，潛伏感染的病毒常會被激活，導致嚴重的甚至是致命性的后果。因此，關(guān)于巨細胞病毒的預防和治療研究日益受到重視。 HCMV也同其它病毒一樣，通過吸附、侵入細胞、復制及釋放這一循環(huán)方式在人體內(nèi)存活，能逃逸免疫識別并持續(xù)感染。病毒吸附到宿主細胞上是病毒感染和擴散的起點，阻斷病毒的吸附對于防止病毒感染具有至關(guān)重要的意義。HCMV糖蛋白B(gB，glycoproteinB)為HCMV包膜中最豐富的

3、糖蛋白，占包膜蛋白的50％以上。gB是由跨膜蛋白gp55(glycoprotein55)和表面蛋白gp116(glycoprotein116)組成的Ⅰ型膜糖蛋白。gp55位于羧基端，攜帶占免疫優(yōu)勢的抗原決定簇，gp116位于氨基端，亦攜帶抗原決定簇，蛋白復合物總長為906個氨基酸。gB的主要致病機制在于提高病毒體穿透力，促進細胞間感染的擴散。研究表明，HCMVgB的中和抗體能阻斷病毒感染。吸附抑制和感染力中和實驗表明這些抗體能阻止病毒體

4、向細胞穿透。電鏡分析顯示，抗體能阻斷感染的擴散，抗體中和的HCMV病毒體滯留在細胞表面，細胞內(nèi)的病毒顆粒減少。因此gB是一個非常重要的HCMV治療靶標。目前HCMVgB抗原性的研究已較為清楚，已發(fā)現(xiàn)的三個線性抗體結(jié)合位點中，其中兩個是病毒中和抗體的靶位。AD1是gB中首要的抗體結(jié)合位點，該抗原決定簇由位于552-635氨基酸間的84個氨基酸組成。HCMV感染的病人血清中g(shù)B特異性抗體反應(yīng)中50％以上直接針對AD1。gB的第二重要的抗體結(jié)

5、合位點為AD2，該抗原決定簇由位于50-86氨基酸間的37個氨基酸組成。HCMV感染的病人血清中g(shù)B特異性抗體反應(yīng)中30％以上針對AD2(2,3,4)。 目前在臨床上治療CMV的常用藥物，如ganciclovir、valganciclovir、cidofovir等是核苷酸的衍生物或類似物，雖然對病毒的復制和增殖具有較好的阻止作用，但是這些藥物在阻止病毒復制與增殖的同時，對宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和復制過程造成嚴重影響，具有較強的毒副作用。

6、鑒于上述抗病毒藥物的缺陷，人們開始關(guān)注采用免疫方法對CMV進行防治。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，特異性抗病毒人源化抗體已經(jīng)成為病毒性疾病預防和治療最有前景的生物制品之一。 本研究分別以位于AD1和AD2的表位肽P1和P2為靶標，收集HCMV病毒抗體陽性患者的外周血淋巴細胞，提取RNA，設(shè)計合成引物，通過RT-PCR分別獲得抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，將重鏈和輕鏈連接后，構(gòu)建噬菌體抗體庫；將抗體庫用于篩選抗P1和P2表位肽的抗體，經(jīng)過多次的

7、構(gòu)庫和篩選后，隨后對陽性克隆進行了初步鑒定，獲得了4株抗體不僅能與表位肽P1結(jié)合，而且能與gB完整蛋白結(jié)合，具有良好的特異性。為后續(xù)開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物工程藥物打下良好的基礎(chǔ)。 材料和方法:主要試劑和儀器設(shè)備(略)主要方法1.收集HCMV抗體陽性患者外周血淋巴細胞，通過ELISA檢測試劑盒鑒定HCMVIgG陽性標本。 2.采用不連續(xù)梯度法分離外周血淋巴細胞；用Trizol法提取淋巴細胞的RNA，變性凝膠電泳檢測RN

8、A的完整性；通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA，以β-actin為內(nèi)參進行PCR，判斷逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是否成功；取逆轉(zhuǎn)錄成功的樣品進行PCR，分別擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼序列，純化后通過overlapPCR將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼片段裝配成ScFv片段，將裝配后的片段以及載體pComb3X分別用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ酶切，經(jīng)凝膠電泳分離純化后連接，電轉(zhuǎn)化構(gòu)建人源化抗體庫。 3.從GenBank搜索目前已知的5種人巨細胞病毒外膜糖蛋白gB

9、蛋白序列，應(yīng)用cluster程序進行序列比對，確定gB蛋白的保守區(qū)域。在此基礎(chǔ)上，分析外膜糖蛋白gB的親疏水性、可及性、抗原性以及二級結(jié)構(gòu)等參數(shù)，綜合生物信息學和文獻分析，設(shè)計并合成表位肽。 4.對抗體庫進行篩選，并對獲得的陽性克隆用ELISA、dot-blot和western-blot進行初步鑒定。并將鑒定后的抗體序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫。 主要結(jié)果1.臨床患者外周血標本的收集和檢查2.共收集臨床患者外周血標本21

10、6例，其中HCMVIgG陽性標本159份，HCMV抗體陽性率72.2％，與以往資料所顯示的數(shù)據(jù)大致相當。 3.外周血淋巴細胞RNA的提取、引物的設(shè)計和抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列的擴增 4.共提取外周血淋巴細胞RNA159份，RNA電泳結(jié)果顯示完整性良好；內(nèi)參β-actin擴增后顯示逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成功；抗體重鏈可變區(qū)編碼序列的RT-PCR擴增產(chǎn)物長度約為400bp，抗體kappa、lamda輕鏈可變區(qū)編碼序列RT-PCR結(jié)果

11、在350bp左右；成功獲得55種RT-PCR擴增組合。 5.重鏈輕鏈可變區(qū)編碼序列的裝配以及抗體庫的構(gòu)建6.ScFv片段在750-800bp之間；經(jīng)12批共66次電轉(zhuǎn)化后構(gòu)建的抗體庫總?cè)萘考s為4.5*108，為后續(xù)篩選抗巨細胞病毒人源化抗體奠定了基礎(chǔ)。 7.巨細胞病毒外膜糖蛋白gB表位肽的選擇8.設(shè)計和合成表位肽P1TEECQLPSLKIFIAG(607-621位于AD1)和P2NETIYNTTLKYGDVV(70-84

12、位于AD2功能域)，作為靶標篩選抗體庫。 9.抗體庫的篩選和陽性結(jié)果的初步鑒定10.獲得針對P1的噬菌體抗體44株，P2的篩選沒有陽性結(jié)果；測序獲得5株P(guān)1的噬菌體抗體序列，分別為P1-24、P1-25、P1-26、P1-28、P1-29；鑒定出能同時與表位肽P1和gB完整蛋白結(jié)合的噬菌體抗體4株，分別為P1-24、P1-25、P1-26、P1-28。依次將鑒定后的序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列編號分別為DQ001147、D