人巨細胞病毒潛伏—激活感染診斷的進展

1、臨床免疫學檢查,上海交通大學醫(yī)學院季育華 教授,范疇(category)：,1、感染性疾病(infection disease)2、自身免疫性疾病(autoimmune ～)3、超敏反應性疾病(hypersensitivity ～ )4、免疫缺陷/增殖性疾病(immunoabnormal ～ deficiency/proliferation)5、腫瘤(tumour)6、移植(transplantation),手段(meas

2、ure)與目的(objective)：,應用免疫學的理論(theory)與技術(technique)，研究疾病的病因(致病)(pathogenesis)、發(fā)生(occur)、發(fā)展(develop)和轉歸(turn)，并對疾病進行診斷(diagnosis)、療效監(jiān)測(curative effect monitor)和預防(prevent)。,內容(content)：,1、體液免疫檢測(humoral～) 2、細胞免疫檢測(

3、cellular ～) 3、相關臨床疾病的免疫檢測 感染性疾病 自身免疫性疾病 超敏反應性疾病 免疫缺陷/增殖、腫瘤與移植,一、體液免疫檢測(～test),（一）血清免疫球蛋白檢測 (human serum immunoglobulin ～)（二）血清補體檢測 (human serum complement ～)（三）體液免疫相關其他檢測

4、(others ～),（一）血清免疫球蛋白檢測,免疫球蛋白（Immunoglobulins, Ig）是具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白。 可分為分泌型和膜型兩種，前者主要存在于血清等體液中，如Ab；后者稱膜型免疫球蛋白（membrane Ig，mIg），是B細胞膜上的抗原受體(receptor)。,,抗體（antibodies, Ab）是B細胞識別抗原后增殖分化為漿細胞所產生的，能與相應抗原特異性(specif

5、ic)結合(recognize antigen and binding)并發(fā)揮免疫功能(antigen and antibody reaction)的球蛋白。,所有抗體都是免疫球蛋白， 但免疫球蛋白不都是抗體。,臨床檢測的血清免疫球蛋白,健康人血清主要Ig含量(content)（g/L）,年 齡 IgG IgM IgA新生兒 6.6～17.5 0.01～0.06 0.0

6、6～0.216個月 2.6～6.9 0.08～0.57 0.26～1.001 歲 3.0～9.5 0.14～0.91 0.37～1.502 歲 4.7～12.3 0.21～1.45 0.41～1.758 歲 6.3～15.0 0.46～2.51 0.47～2.2012歲 7.0～15.5 0.58～2.91 0.49～2.4018歲 7.3～15.5

7、0.70～3.21 0.51～2.61成人 7.0～16.0 0.70～3.00 0.40～2.80,檢測手段(method)：,(PrecipitationReaction),(In fluid phase),(In agar),（ring、immune-turbidity、et al）,（diffusion）,（electrophoresis）,,,(In fluid phase )絮狀沉淀試驗：,Ag,Ab

8、,,環(huán)狀沉淀試驗,,,,,透射免疫比濁：,（turbidimetry）,在直射角度上測定光的透射強度，以吸收光單位（A）表示， A值與復合物量呈正比。,,散射免疫比濁（終點散射/速率散射）：,（nephelometry） 在光路的5°-95°角的方向上測量散射光強度和被測溶液中微粒濃度關系的一種方法。 散射光：一定波長的光線沿水平軸通過復合物的混合液時導致光散射，散射光的強度與復合物量呈正比。 測定

9、抗原抗體反應達平衡時～ ，終點（end） 測定單位時間內抗原抗體形成最大量時～，速 率（rate）,臨床意義（significance）：,1.血清多克隆Ig水平增高 患者血清中各型Ig均升高，常見于各種感染特別是慢性(chronic)細菌感染，如肺結核、慢性支氣管炎、慢性肝病自身免疫性(autoimmune)疾病。SLE患者以IgG、IgA升高較多見，類風濕性關節(jié)炎——IgM增高為主。,,多克隆抗體(pol

10、yclonal antibody): 由不同的B細胞克隆產生的抗體.單克隆抗體(monoclonal antibody): 由一個細胞克隆所產生的只識別單一 抗原決定簇的純的抗體.,,2.血清單克隆Ig水平增高 患者血清中出現異常增多的單克隆蛋白（monoclonal protein，MP（即M蛋白））達30g/L以上，而正常Ig包括與MP同類Ig的含量則顯著降低。此類異常增多Ig多無免疫活性,主要見于免

11、疫增殖性(immunoproliferative)疾病，如多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM),原發(fā)性巨球蛋白血癥(primary macro-globulinemia)、重鏈(heavy chain)病、輕鏈(light chain)病等。,,新生兒、嬰幼兒由于體液免疫功能尚不成 熟，免疫球蛋白的含量較成人低，需按年 齡組進行分析與判斷。關于血清IgE和IgD的測定： 血清總IgE為0.13～0

12、.92mg/L; 血清總IgD為0.6～2.0mg/L; IgE值升高多見于超敏反應性疾病,骨髓瘤 IgD值升高多見于骨髓瘤等。,異常免疫球蛋白檢測：,M蛋白/（Monoclonal immunoglobulins ） 由一種單克隆B淋巴細胞異常增殖時產生的 具有相同結構和電場移動率的Ig分子或分子片段，一般不具有抗體活性,又稱副蛋白（paraprotein）。冷球蛋白（cryoglobulin） 指血清中一種

13、蛋白，4℃不溶解，30℃易于 凝聚，37℃便溶解。存在于多種疾病，參 與炎癥或免疫復合物引起的疾病。,M蛋白的檢測（免疫固定電泳） (immunofixation lectrophoresis),操作：待檢血清 + 抗血清IgG IgA IgM Κ鏈

14、 λ鏈 I抗原抗體對應沉淀并被固定，染色等,結果(result)：,與M蛋白檢測相關(related)疾?。?1、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）2、巨球蛋白血癥（macroglobulinemia）3、重鏈?。╤eavy chain disease）4、輕鏈?。╨ight chain disease）5、半分子病（half-molecule im

15、munoglobulin disease）6、惡性淋巴瘤(malignant ～)7、良性M蛋白血癥(benign ～),例:,多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM） 是漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，也稱漿細胞瘤（plasmocytoma）。是IPD中最常見的一種類型。1873年由Butzky首先并命名。,MM的主要臨床特征：,①進行性的骨質破壞，如骨質疏松和溶骨性病變，常有骨痛、易骨折，為MM最典型特征；②

16、大量的M蛋白導致血液粘度增高,呈高粘血癥或沉積于腎小管中，腎小管上皮細胞淀粉樣變性，發(fā)生腎病綜合征。損害中樞神經系統(tǒng)，可出現神經功能障礙；③骨髓損傷可引起貧血、粒細胞和血小板減少；④漿細胞浸潤其他組織，如脊髓和神經根受壓時引起運動功能障礙等；⑤男性多發(fā)，平均發(fā)病年齡46歲左右；⑥惡性程度高，預后不良；⑦易感染。,MM的主要免疫學特征：,①血清中出現大量的M蛋白：IgG＞35g/L, IgA＞20g/L, IgM＞15g

17、/L, IgD＞2.0g/L，IgE＞2.0g/L；或尿中有本周蛋白（＞1.0g/24h尿）；②血清中正常Ig 水平明顯降低；③骨髓中有無限擴增的異常漿細胞（≥15%）為主要病理特征，組織證實有漿細胞瘤；④有溶骨性損害。,不同類型的多發(fā)性骨髓瘤:,類 型 發(fā)生率（%） 本周蛋白尿陽性（%） 臨 床 特 點 IgG 50～60 50～70

18、 典型癥狀 IgA 20～25 50～70 高粘綜合征較多見 IgD 1～2 90 骨髓外病變、溶骨病 變多見，44%淀粉樣變 IgE

19、 0.01 少見 IgM ＜1 90 高粘綜合征最常見非分泌型 1～5 無 溶骨病變較少，神 經系統(tǒng)損害較

20、多見,MM的發(fā)病機制,發(fā)病機制不明，與下列因素有關。（1）是遺傳與環(huán)境因素綜合作用的結果。主要發(fā)生在1號、11號、14號染色體，使?jié){細胞可發(fā)生永生化（2）造血干細胞的異常 。形成漿細胞瘤。（3）細胞因子的異常 。MM患者可有IL-6異常增高，體外內實驗證明IL-6可促使MM細胞增殖、生長和存活，使MM細胞增多。IL-6增高直接效應是抑制IL-4的產生，從而抑制了正常的體液免疫功能。（4）與粘附分子、IL-6等信號傳遞受體

21、和B細胞1～2等抑制凋亡的受體高表達有關。,,本周蛋白（bence-jones protein）: 1847年由Bence-Jones在病人的尿液中檢出而命名。已知M蛋白不具有免疫活性，無正常免疫球蛋白的功能，其輕鏈分子小可通過腎小球濾過從尿排除。（本周蛋白是從尿中檢出的M蛋白輕鏈）,冷球蛋白的檢測(定性)：,,冷球蛋白的定量分析鑒定沉淀中蛋白質類型，可將沉淀用冷緩沖液洗滌后，再溶于巴比妥緩沖液中，固定電泳或免疫電泳鑒

22、定。冷球蛋白檢測的注意事項采血過程要保溫，用品用預溫，4℃下放置時間要一周，正常人血清也可含有冷球蛋白，多數在80μg/L 以下。,（二）血清補體檢測,補體（complement）是指血清中具有酶活性的一組不耐熱球蛋白。A. C1～C9(C1q、r、s)；B. B因子、D因子、P因子、H因子；C. C1抑制物、C4結合蛋白、促衰變因子 等。,溶血程度與補體含量的關系:,補體相關的實驗室檢測：,1、總補體溶血活性測定（

23、CH50） 反映主要補體C1～C9成分的綜合水平。 試管法：正常參考值范圍 50 ～100U/ml 脂質體免疫法：其范圍23 ～46U/ml 測得值高：急性炎癥、損傷、惡性腫瘤 測得值低：補體消耗相關疾病 補體合成降低（肝?。?先天性缺陷,,2、補體單個成分檢測（C3、C4、C1q） 方法:免疫比濁法、單向免疫擴散法,補體單個成分檢測的意義:,若血清

24、C3含量增高，由于C3是急性時相反應蛋白，在急性炎癥、傳染病早期、急性組織損傷、惡性腫瘤、移植物排斥反應時增高。但是補體含量增高的臨床意義不大。若血清C3含量降低，見于合成能力低下，如慢性肝病；合成原料不足，如營養(yǎng)不良；補體消耗或丟失增多，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期、白血病化療后、大量失血、大面積燒傷。血清C4含量降低，見于多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性血管性水腫、遺傳性C4缺乏癥等。,二、細胞免疫(cellular～)檢測,參與機

25、體細胞免疫反應的細胞 T淋巴細胞 B淋巴細胞 NK細胞（自然殺傷） 中性粒細胞針對細胞的數量(amount)、活性（功能 function）、表面標志物(membrane molecules )表達(express)程度～。,T細胞表面標志物(主要):,1、羊RBC受體(E花環(huán))2、T細胞抗原受體（T cell receptor,TCR)3、CD3,CD4/CD8；CD28,152,15

26、4和CD2等（Cluster of differentiation；CD）4、絲裂原受體（PHA/ConA～）5、MHC分子（MHV-Ⅰ類分子）6、細胞因子受體～,臨床常見的細胞免疫檢測項目,T細胞表面標志物檢測(membrane molecules of T lymphocytes～)通過檢測T淋巴細胞表面特有的標志物識別，計數細胞總數；分析細胞亞群。方法：E玫瑰花環(huán)形成試驗(Erythrocyte rosette

27、forming cell test) T細胞分化抗原（CD）測定(Cluster Differentiation of T cells～ ),E玫瑰花環(huán)形成試驗:,T細胞表面有特異性綿羊紅細胞 (SRBC) 受體，即E受體。將T細胞與SRBC按一定比例混勻，置4℃至少2h或過夜，T細胞表面的E受體能與SRBC結合形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結構（見圖)鏡檢計數可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細胞的百分率。,,正

28、常參考值范圍 Et 64.4±6.7% Ea 20%～40%,,流式細胞術(flowcytometry,FCM) ：CD3+T細胞 61～85%；CD4+T細胞 28～58%；CD8+T細胞 19～48%；CD4+/CD8+T細胞比值 1.66±0.33(＞1)。,T淋巴細胞功能檢測(function～),T淋巴細胞體外培養(yǎng),在有絲分裂原作用下細胞內核酸與蛋白質合成增加,細胞發(fā)生母

29、細胞化(transformation )～,或經混合(mixed) 淋巴細胞培養(yǎng)等來幫助細胞免疫功能評估。方法：形態(tài)學(morphologic counting ) 3H-胸腺嘧啶核苷摻入法 (3H-thymidine incorporation) MTT法(MTT colorimetry) Mixed lymphocyte culture (one-way/two-w

30、ay),,,Lymphocyte transformation (%) =(transferred lymphocyte)÷200×100% Reference value: ～70%,,(3H-thymidine incorporation): T細胞經有絲分裂原刺激，向母細胞轉化時胞內DNA合成活躍， 3H-胸腺嘧啶核苷作為原料攝入， 3H-胸腺嘧啶核苷的摻入量與細胞增殖相關（SI＞2，正常）,,S

31、timulating index (SI) = mean CPM of the stimulated cells/mean CPM of the corresponding control Cells (unstimulated=control ),,MTT法(colorimetry): 細胞增殖代謝活躍，細胞內線粒體脫 氫酶活性增高，通過線粒體能量代謝 使得MTT代謝形成紫色甲潛，經細胞溶 解分析吸光度，估計細胞增殖程

32、度(SI＞2)。 methyl thiazolyte trazolium;MTT 四甲基偶氮唑鹽,為一種染料.,,,混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixed culture)： 將兩個無關的淋巴細胞混合培養(yǎng)，由于不同個體MHC的差異，彼此都以對方為抗原發(fā)生反應，導致T細胞轉化。 T細胞轉化能力可通過3H-胸腺嘧啶核苷摻入法、MTT法，檢測分析。,B淋巴細胞表面標志物檢測,B淋巴細胞表面標志物： 1、膜表面免疫球蛋白（

33、SmIg） 2、分化抗原（CD19～22和CD29） 3、Fc受體(Fc receptor) 4、補體受體(complement receptor) 5、EB病毒受體等(EB virus receptor),,檢測方法(method)： 1、免疫熒光(fluorescence immunoassay)法測SmIg（用5種抗Ig抗體+B細胞——熒光顯微鏡下計數）.參考值: SmIg+細胞總數16～28%，其中G+ 4～1

34、3%；M+7～13%；A+1～4%；D+5～8%; E+0～1.5%。 2、流式細胞術(flowcytometry,FCM)檢測B細胞分化抗原（CD19）.參考值: CD19+細胞 11.74%±3.73%,B淋巴細胞功能檢測(function):,1、B淋巴細胞增殖(proliferation)試驗2、溶血空斑(hemolytic plaque)試驗3、酶聯免疫斑點法（ELISPOT）4、體內試驗（皮試）(Ⅰ/

35、Ⅳ),,,ELISPOT:,用抗原包被固相，加入待檢的抗體產生細胞，再誘導其抗體的分泌。分泌的抗體與包被于固相的抗原結合，在抗體形成細胞周圍形成抗原抗體復合物。再加入酶標記二抗，通過底物的顯色反應鏡下計數著色斑點，并記錄顯色的深淺、范圍，可評估B細胞功能～,,,,,,,,A and B：檢測標本（刺激后的待測細胞）E and F：檢測抗體對照（相同數量刺激后的待測細胞，使用PBS替代了檢測抗體）C and D：陰性對照（相同數量

36、的未刺激細胞）G and H：背景對照（只加入培養(yǎng)基，無細胞）H1 and H12：陽性對照（重組的細胞因子）,檢測模式和結果示意圖,體內試驗（皮試）,正常機體對某種抗原建立了細胞免疫后，如用相同的抗原做皮膚試驗時，常出現陽性的遲發(fā)型超敏反應。本試驗不僅可以檢查受試者是否對某種抗原具有特異性細胞免疫應答能力，而且可以檢查受試者總體細胞免疫狀態(tài)。,體內試驗（皮試）:,B細胞功能減低或缺陷，可表現為體內Ig 和血型抗體量下降或缺如，患者

37、對外源性抗原的應答能力減弱或缺如，僅產生極低或不能產生特異性抗體。故臨床定量測定受檢者血清中各種Ig量和相應血型抗體可判斷B細胞功能，也是診斷體液免疫缺陷的重要指標。反之，如血清中一種或多種Ig或輕、重鏈片段異常增高，表明B細胞產生Ig的功能異常增高。,,4、自然殺傷細胞（NK）免疫檢測：NK為一類大顆粒淋巴細胞，其表面無專門的識別標志，具有細胞介導的細胞毒作用能直接殺傷靶細胞。NK具有抗腫瘤、抗感染和免疫調節(jié)等功效，還參與

38、移植排斥、超敏反應等～NK功能測定：包括乳酸脫氫酶釋放率、51Cr釋放等等 。,,5、吞噬細胞（phagocytes）功能檢測： 吞噬細胞 — 中性粒細胞（neutrophils） 單核-吞噬細胞 （mononuclear ～/macrophages） 吞噬細胞的吞噬活力 — 趨化（trend） 吞噬（phagocytosis） 胞內消化（el

39、imination）,,,細胞免疫相關的主要細胞因子檢測：,,細胞因子(cytokines):由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的，介導和調節(jié)免疫、炎癥反應的小分子多肽。細胞因子少入血，檢測局部含量有意義；細胞因子具網絡特性，聯合檢測多信息分析有意義。,,細胞因子的種類：,1、白細胞介素（ IL-1～18）2、集落刺激因子（CSF）（粒、巨噬細胞和混合～）3、干擾素（IFN）（α、β、γ）4、腫瘤壞死因子（TNF）（ α、 β

40、） 5、轉化生長因子β家族/ （SGF）6、趨化因子家族7、其他（表皮生長、血小板衍生～）,常見細胞因子檢測方法：,1、生物學檢測法（促細胞增殖和增殖抑制、細胞毒活性、抗病毒活性、趨化活性等）。2、免疫學檢測法（ELISA、RIA、免疫印跡、免疫斑點）。3、分子生物學法（RNA印跡、PCR等）。4、單個細胞產生細胞因子測定法（反向溶血空斑、反向ELISA斑點）。,IL-2/ IL-2R,IL-2主要由活化的CD4+細胞

41、產生，通過自分泌和旁分泌作用于分泌IL-2的細胞本身或近鄰的CD4+和 CD8+細胞，是機體免疫網絡中最重要的調節(jié)因子。為評價機體免疫功能的重要指標之一。體液中含量低難以直接檢測。通常檢測由刺激原（PHA/ConA）誘導單個核細胞在體外產生其的能力來反映。,IL-4,主要由Th細胞經抗原或絲裂原刺激后產生可調節(jié)B細胞及其他多種免疫細胞的功能。IL-4能增加亞劑量IgM抗體對B細胞的刺激IL-4與LPS共刺激B細胞分泌IgG1和

42、IgEIL-4能促進B細胞膜表面CD23分子表達IL-4能阻斷IFN對L929細胞的保護作用，呈顯拮抗IFN的抗病毒活性。,IL-6,IL-6由多種淋巴類和非淋巴類細胞（單核-巨噬細胞、血管內皮細胞、T/B細胞、某些腫瘤細胞）產生，具有多種生物學功能，在機體的免疫應答、骨髓造血、炎癥反應中起重要作用。IL-6能刺激某些細胞分化（CESS細胞、SKW6-CL4細胞、B細胞等）,IL-8,IL-8由單核/巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞

43、和內皮細胞的多種細胞產生，其主要生物活性是激活中性粒細胞。IL-8是中性粒細胞的激活劑和趨化因子IL-8刺激多型核白細胞釋放髓過氧化物酶,細胞黏附分子,細胞黏附分子分類(classified),整合素家族(integrin) 選擇素家族(selectin) 免疫球蛋白超家族 (immunoglobulin superfamily) 鈣粘蛋白家族(cadherin) 粘蛋白樣家族、等等 （mucin-like

44、family）,黏附分子的功能(function),1、免疫細胞識別（distinguish）中的輔助受體和協(xié)同活化信號。2、炎癥（inflammatory）過程中白細胞和血管內皮細胞黏附。3、淋巴細胞歸巢 （lymphocyte homing）。,黏附分子與疾病(and disease),黏附分子與腫瘤 (and tumour),可溶性黏附分子（dissolved～）,指從細胞表面脫落并直接進入血液的～已知某些黏附分子由其mR