人巨細(xì)胞病毒潛伏感染下細(xì)胞的自噬現(xiàn)象.pdf

1、目的：
　　人巨細(xì)胞病毒(HCMV)在人群中普遍感染，盡管HCMV在健康個(gè)體中的感染通常是無(wú)癥狀性感染，但對(duì)于存在免疫缺陷的個(gè)體，HCMV是導(dǎo)致其患病和死亡的主要原因。HCMV也是目前公認(rèn)的引起先天性感染最常見病原體，常導(dǎo)致新生兒畸形的發(fā)生。細(xì)胞自噬(autophagy)是一種主要由溶酶體介導(dǎo)的降解通路，作為細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)性機(jī)制，不僅可以通過(guò)將長(zhǎng)壽命蛋白和衰老細(xì)胞器降解為小肽或氨基酸為細(xì)胞提供再生資源，而且也可作為宿

2、主防御機(jī)制抵抗病原微生物的感染和寄生。近年對(duì)HCMV與自噬關(guān)系的研究也取得重要進(jìn)展，但現(xiàn)有關(guān)于HCMV和自噬之間關(guān)系的研究都是在HCMV增殖感染的細(xì)胞上進(jìn)行的，對(duì)于HCMV潛伏感染這種人群中更為普遍的感染模式，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)自噬的影響。明確HCMV潛伏感染時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬的影響，這將有助于闡明HCMV潛伏感染的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為HCMV防治藥物和疫苗的研發(fā)提供新靶標(biāo)。
　　方法:
　　本研究主要包括兩部分:1）人巨細(xì)胞

3、病毒潛伏感染模型的建立:以HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞(Human Embryo Lung Fibroblast，HEF)作為HCMV增殖感染對(duì)照組，以未感染的人急性單核白血病細(xì)胞（human acute monocytic leukaemia cellline，THP-1）作為空白對(duì)照組，用HCMV Towne株分別感染THP-1細(xì)胞和HEF細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);在感染后6h、5d、7d時(shí)去培養(yǎng)上清，收集細(xì)胞，用DNA抽提試

4、劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總DNA，熒光定量PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞內(nèi)HCMV的DNA拷貝數(shù);Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)HCMVIE1、IE2和UL81-82ast基因的表達(dá)水平;用RIPA強(qiáng)裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，western-blot檢測(cè)HCMVIE蛋白水平。構(gòu)建穩(wěn)定的HCMV潛伏感染模型。
　　2)人巨細(xì)胞病毒潛伏感染下細(xì)胞的自噬現(xiàn)象:
　　透射電鏡下觀察HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞后能

5、否在超微結(jié)構(gòu)水平誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn)，并與空白組進(jìn)行對(duì)比;RT-PCR法定量分析HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄水平;western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和Atg5的表達(dá)水平，并和未感染HCMV Towne株的空白組進(jìn)行對(duì)比分析。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建HCMV潛伏感染模型。熒光定量PCR結(jié)果顯示:每個(gè)THP-1細(xì)胞內(nèi)HCMVDNA拷貝

6、數(shù)大約在1.5個(gè)，在感染后1-5d逐漸增加，5d后逐漸減少;RT-PCR結(jié)果顯示:HEF細(xì)胞和THP-1細(xì)胞感染HCMV Towne株后均有HCMV即刻早期基因IE和潛伏相關(guān)基因UL81-82astmRNA的表達(dá)。HCMV Towne株感染的THP-1細(xì)胞，IE2基因mRNA在感染后6h、5d均有表達(dá)，7d后基本不表達(dá);IE1基因mRNA表達(dá)一直不明顯;UL81-82ast基因mRNA在感染后6h即有表達(dá)，并且一直持續(xù)到感染后7d。We

7、stern-blot結(jié)果顯示:在HCMV感染的HEF細(xì)胞，HCMV IE蛋白在感染后6h即有表達(dá)，感染后5d、7d表達(dá)增加。在THP-1細(xì)胞，IE蛋白在感染后6h、5d有表達(dá)，感染后7d時(shí)IE不表達(dá)。
　　HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞的自噬，和空白組THP-1細(xì)胞相比，電鏡結(jié)果顯示:Towne株感染THP-1細(xì)胞后，與空白組相比，病毒感染后1d就能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬體。在感染后5d，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)

8、大量自噬體和自噬溶酶體，局部也能見到池狀彎曲的雙成膜結(jié)構(gòu)的自噬前體，以自噬溶酶體居多。感染后9d，細(xì)胞內(nèi)仍可見自噬體和自噬溶酶體的存在，但仍以自噬溶酶體為主。相比較之下，空白組細(xì)胞漿內(nèi)幾乎沒有自噬相關(guān)囊泡的出現(xiàn)。電子顯微鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)空白組細(xì)胞和感染后1d、5d、9d的感染組細(xì)胞各10個(gè)，在不同的非連續(xù)性區(qū)域計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)囊泡的數(shù)量:空白組細(xì)胞約2-3個(gè)自噬體或自噬溶酶體;感染后1d的細(xì)胞約10-13個(gè);感染后5d的細(xì)胞約80

9、個(gè);感染后9d的細(xì)胞約30個(gè)。與空白組相比，自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在HCMV感染后明顯增加。促進(jìn)自噬的強(qiáng)度也存在變化:HCMV感染THP-1細(xì)胞5天后，在THP-1細(xì)胞上能建立穩(wěn)定的潛伏感染，在潛伏感染期間，HCMV促進(jìn)細(xì)胞自噬的強(qiáng)度較未建立潛伏感染之前減弱，表現(xiàn)為自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1和Atg5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在潛伏期間逐漸減少，但和空白組細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平仍高。
　　結(jié)論: