人源化小鼠模型的構(gòu)建及人巨細(xì)胞病的的監(jiān)測(cè).pdf

1、造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是治療血液系統(tǒng)疾病如白血病、骨髓增生異常綜合癥、再生障礙性貧血、淋巴瘤等有效方法之一。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，HSCT在臨床中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，雖然移植技術(shù)及方法都有了很大進(jìn)步，但HSCT后人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染依然是影響患者長(zhǎng)期生存的重要因素之一。HCMV感染在中國(guó)人群中非常普遍，大約95

2、％的中國(guó)人感染過(guò)HCMV。HCMV的感染率隨著年齡的增加而增多，它可以通過(guò)唾液、尿液、性接觸及血液制品傳播。HCMV感染分為原發(fā)感染、再發(fā)感染和潛伏感染：①原發(fā)感染：初次感染，即在HCMV血清學(xué)陰性患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HCMV或其產(chǎn)物；②再發(fā)感染：HCMV血清學(xué)陽(yáng)性患者體內(nèi)潛伏的病毒再次激活或再次感染不同的外源性HCMV病毒株；③潛伏感染：HCMV基因組DNA持續(xù)存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，任何檢測(cè)方法都無(wú)法檢測(cè)到病毒產(chǎn)物，但在免疫力低下的時(shí)候HCMV被

3、激活，產(chǎn)生新的病毒顆粒。HCMV病指通過(guò)活檢獲得的標(biāo)本或其他有創(chuàng)操作獲得的標(biāo)本采用敏感性和特異性檢查方法檢測(cè)到HCMV，同時(shí)伴有相應(yīng)器官感染的癥狀和（或）體征。HCMV病包括：間質(zhì)性肺炎，視網(wǎng)膜炎，腸炎和其他少見(jiàn)的如出血性膀胱炎和肝炎等。
　　對(duì)于免疫系統(tǒng)功能正常的人來(lái)講，HCMV感染后常無(wú)任何臨床癥狀，但一旦感染后HCMV即可在體內(nèi)終身潛伏，潛伏在血液系統(tǒng)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）及造

4、血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）中。在免疫力低下者（如嬰幼兒、艾滋病、HSCT、實(shí)體器官移植等）無(wú)論是HCMV原發(fā)感染或再激活，都會(huì)產(chǎn)生明顯的癥狀甚至嚴(yán)重的HCMV病。HSCT后HCMV的感染很常見(jiàn)，尤其是發(fā)生急性移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）的患者，其發(fā)生HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)更高[7,8]。HCMV血清學(xué)陽(yáng)性的受者移植后100d內(nèi)約45%～85%出現(xiàn)HCM

5、V原發(fā)感染或再激活感染，在不用抗病毒藥物治療的情況下，這些患者中約有25%～30%將要進(jìn)展為HCMV終末器官疾病。HCMV肺炎是致命性疾病，病死率高達(dá)90%，并且發(fā)病率也較高，自體HSCT（auto-HSCT）其發(fā)病率為1%～6%，異基因HSCT（allo-HSCT）發(fā)病率約為10%～30%。HCMV肺炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括淋巴細(xì)胞減少癥、男性及嚴(yán)重的GVHD。
　　HCMV感染對(duì)人們的危害已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。目前全球每年共約有1

6、3萬(wàn)以上的實(shí)體器官移植及HSCT，而HCMV感染是導(dǎo)致患者移植后死亡的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，8%～32%的腎移植患者、39%～41%的肺或心臟移植的患者、22%～29%的肝移植患者、50%胰腺移植患者均受累于HCMV感染。HCMV感染也是導(dǎo)致新生兒缺陷最主要的感染性因素，且發(fā)現(xiàn)HCMV感染與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，如宮頸癌、結(jié)直腸癌等，HCMV感染還是心血管疾病發(fā)生的共同致病因素。
　　目前HCMV感染機(jī)制仍然不完全明確，HCMV的治

7、療方式主要是化學(xué)藥物及細(xì)胞免疫治療，但各自都有其局限性。CMV具有高度的種屬特異性，即HCMV不能直接感染小鼠，鼠巨細(xì)胞病毒（mouse cytomegalovirus，MCMV）也不能直接感染人。因HCMV會(huì)潛伏到造血干/祖細(xì)胞中，所以本試驗(yàn)主要是探索性研究利用粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）動(dòng)員的HCMV血清學(xué)陽(yáng)性供者外周血CD34+HSC建立Hu-HSC-

8、NPGTM（NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1vst/vst）模型，同時(shí)在小鼠的血液、組織器官檢測(cè)是否發(fā)生HCMV的感染，以期為研究HCMV感染機(jī)制、治療提供動(dòng)物模型平臺(tái)。本研究主要分為兩個(gè)部分：
　　首先，實(shí)驗(yàn)組小鼠移植前眼眶取血，NPG小鼠照射后4～24小時(shí)內(nèi)，骨髓腔注射磁珠分選的CD34+干細(xì)胞，觀察小鼠的生存狀態(tài)；移植后的第10 d處死一只照射后的小鼠及未照射的小鼠，取出小鼠的股骨，福爾馬林液固定，制作病理切

9、片，觀察清髓效果；移植后第2周和第4周眼眶采血檢測(cè)小鼠血象恢復(fù)情況；移植后第4、6、8、10、12周用流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠外周血中人CD45+細(xì)胞比例。
　　其次，移植后用PCR方法檢測(cè)小鼠外周血中是否檢測(cè)到HCMV的DNA拷貝數(shù)；12周后處死各組小鼠，取出小鼠的肝臟、脾臟及骨髓細(xì)胞，檢測(cè)骨髓、肝臟、脾臟細(xì)胞CD45+、CD19+細(xì)胞表達(dá)及是否存在HCMV的感染；取出小鼠的肺及腸道組織經(jīng)福爾馬林固定，制作組織切片，免疫組化檢測(cè)腸

10、道及肺臟是否感染HCMV；提取小鼠骨髓細(xì)胞DNA，運(yùn)用PCR方法檢測(cè)骨髓細(xì)胞人Alu基因的表達(dá)情況。
　　通過(guò)試驗(yàn)可以得出以下結(jié)果：①磁珠分選的CD34+干細(xì)胞純度可高達(dá)96.3%；②NPG小鼠照射后骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞及巨核細(xì)胞數(shù)量均明顯減少甚至消失，達(dá)到了清髓的效果；③實(shí)驗(yàn)組小鼠第4周外周血白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板恢復(fù)到移植前水平；④實(shí)驗(yàn)組小鼠在第4、6、8、10、12周均檢測(cè)到了人CD45+細(xì)胞；⑤利用PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠人

11、Alu基因全部陽(yáng)性；⑥整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血、組織細(xì)胞及免疫組化病理切片中均未檢測(cè)到HCMV。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：骨髓腔注射移植HCMV血清學(xué)陽(yáng)性供者外周血CD34+干細(xì)胞至NPG小鼠均可以在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到人CD45+細(xì)胞，說(shuō)明可以建立人鼠嵌合模型；在NPG小鼠組織細(xì)胞、血液中均未檢測(cè)到HCMV，說(shuō)明HCMV血清學(xué)陽(yáng)性CD34+造血干細(xì)胞能否使NPG小鼠感染HCMV，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　過(guò)去人源化小鼠模型大多是以尾靜脈

12、注射臍血單個(gè)核細(xì)胞移植到NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠。HCMV感染小鼠模型是將人的HCMV在體外與人胚肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后通過(guò)腹腔注射到小鼠體內(nèi)，觀察其感染情況，雖然此辦法可行，但不能研究HCMV潛伏感染-再激活機(jī)制及不能為細(xì)胞免疫治療提供動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于選擇目前國(guó)際上最適合做移植、免疫缺陷程度最高的NPG小鼠，模擬臨床HCMV血清學(xué)陽(yáng)性供者干細(xì)胞回輸給陰性患者的情況，探索性的研究利用HCMV血清學(xué)