人巨細(xì)胞病毒IE1核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫效果的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE1核酸疫苗pcDNA3.1(-)-IE1,通過免疫BALB/c小鼠,初步研究其產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,為進(jìn)一步研發(fā)HCMV IE1疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)將重組載體pEGFP-C1-IE1用 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切與載體pcDNA3.1(-)連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-IE1,雙酶切鑒定。
　　(2)將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-I

2、E1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,RT-PCR及Western blot測(cè)定IE1在真核細(xì)胞的表達(dá)。
　　(3)將pcDNA3.1(-)-IE1、對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)及PBS分別通過肌肉注射8 w齡BALB/c小鼠,隔2 w免疫1次,共免疫4次。
　　(4)末次免疫小鼠2 w后,取小鼠肌肉組織通過PCR法檢測(cè)IE1基因,免疫組化測(cè)定IE1基因在小鼠肌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　(5)末次免疫小鼠2 w后,無菌制備小鼠脾細(xì)胞,經(jīng)

3、PHA刺激后,ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-2、IFN-γ含量;MTT比色法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-IE1經(jīng)雙酶切后,小片段約1476 bp,與IE1大小一致。
　　(2) pcDNA3.1(-)-IE1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后,RT-PCR檢測(cè)到約1476 b

4、p片段,與IE1大小相符,Western blot檢測(cè)到分子量約72 kDa的IE1蛋白。
　　(3)在免疫小鼠肌細(xì)胞中,利用PCR檢測(cè)到約1476 bp片段,與IE1大小一致,即IE1基因在小鼠肌細(xì)胞中穩(wěn)定存在;免疫組化結(jié)果顯示IE1基因在小鼠肌細(xì)胞中表達(dá)IE1目的蛋白。
　　(4)核酸疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后,培養(yǎng)上清液中:IL-4含量為30.47±1.76 pg/mL,與空質(zhì)粒組(26.88±2.60 p

5、g/mL)和PBS組(25.06±2.60 pg/mL)比較差異有顯著性(P<0.05);IL-2含量為47.98±2.08 pg/mL,與空質(zhì)粒組(19.66±2.45 pg/mL)和PBS組(16.06±2.45pg/mL)比較差異有顯著性(P<0.01);IFN-γ含量為50.47±4.81 pg/mL,與空質(zhì)粒組(28.24±4.18 pg/mL)和PBS(25.06±4.35 pg/mL)組比較差異有顯著性(P<0.001)。

6、
　　(5)核酸疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后,SI為3.55±0.48,與空質(zhì)粒組(1.86±0.23)和PBS組(1.48±0.11)比較差異有顯著性(P<0.001)。
　　結(jié)論:
　　(1)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-IE1,且其能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HCMV IE1蛋白。
　　(2) pcDNA3.1(-)-IE1核酸疫苗能在BALB/c小鼠肌細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且能在其肌細(xì)胞中表達(dá)HC