水稻OsRhoGDI2和OsRacD蛋白相互作用的研究.pdf

1、水稻OsRacD是從雌雄蕊形成期幼穗中分離的小GTP結(jié)合蛋白Rho家族成員。已有的研究提示，該基篩選，獲得了一些潛在的互作蛋白編碼基因。本研究將對其中隆OsRhoGD12基因(AY364312)與OsRacD基因的相互作用進(jìn)行鑒定。
　　運(yùn)用實(shí)時定量PCR技術(shù)分析OsRacD與OsRhoGDI2基因在水稻生長發(fā)育不同階段的葉片以及雌雄蕊形成期幼穗中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者在所檢測的材料中廣泛表達(dá)，且具有相似的變化規(guī)律；同時二者在幼穗組織中

2、表達(dá)量最高，提示OsRacD與OsRhoGDI2基因可能存在協(xié)同表達(dá)的調(diào)控方式。
　　為鑒定OsRacD與OsRhoGDI2的相互作用關(guān)系，首先在酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測野生型、激活型和失活型的OsRacD與OsRhoGDI2的相互作用，發(fā)現(xiàn)野生型和激活型的OsRacD都能與OsRhoGDI2結(jié)合，提示無論OsRacD是否活化，都可以與OsRhoGDI2發(fā)生相互作用。為了確定兩者結(jié)合的位點(diǎn)，基于序列比對的提示，對OsRhoGDI2進(jìn)行

3、序列缺失后，檢測兩者的相互作用，發(fā)現(xiàn)只保留OsRhoGDI蛋白保守結(jié)構(gòu)域不能介導(dǎo)二者的相互作用。進(jìn)一步通過原核表達(dá)和純化，獲得了與GST標(biāo)簽融合的OsRhoGDI2及其缺失突變體蛋白，采用GST pull down檢測與His6標(biāo)簽融合的OsRacD的結(jié)合，結(jié)果與酵母雙雜交分析一致。
　　為了鑒定在植物細(xì)胞內(nèi)OsRacD蛋白與OsRhoGDI2蛋白之間的相互作用，采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，分別將OsRhoGDI2與熒光蛋白YFP基因