凡納濱對蝦Toll2與血藍(lán)蛋白相互作用的研究.pdf

1、我國是對蝦養(yǎng)殖大國，但隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖過程中爆發(fā)的細(xì)菌性疾病和病毒性疾病給對蝦產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失，病害防控成為制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。鑒于此，學(xué)者們普遍認(rèn)為積極研究對蝦自身免疫機制，深入了解對蝦免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是解決目前對蝦養(yǎng)殖疾病的有效途徑之一。近年來，人們發(fā)現(xiàn)Toll是對蝦體內(nèi)的一種重要的病原相關(guān)分子模式受體，但迄今為止，其與其它免疫分子的相互作用及其免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等尚不清楚。有趣的是，本課題組前期采用免疫共沉

2、淀和質(zhì)譜的方法，初步發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦Toll蛋白與血藍(lán)蛋白（hemocyanin，HMC）可能存在相互作用。為此，本研究在此基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)策略對凡納濱對蝦 Toll2與HMC的相互作用展開了進一步的研究，所獲主要研究結(jié)果如下：
　　首先，采用基因克隆和原核表達(dá)技術(shù)，對凡納濱對蝦Toll2進行基因克隆與原核表達(dá)，成功獲得了Toll2重組子（pET-32a-Toll2）及其原核表達(dá)蛋白（Toll2），并通過MAL

3、DI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)該重組表達(dá)蛋白為凡納濱對蝦Toll2蛋白。
　　繼而，在上述研究基礎(chǔ)上，采用免疫接種技術(shù)制備鼠抗蝦Toll2多克隆抗體，經(jīng) Dot-ELISA和Western-blotting驗證，鼠抗蝦 Toll2抗血清可以與Toll2重組蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合。正向Far-Western-blotting實驗表明， Toll2蛋白與HMC孵育后，其可與抗HMC抗體呈明顯的陽性；反向Far-Western-blo

4、tting分析顯示，HMC與Toll2蛋白孵育后，其同樣可與抗 Toll2抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。由此說明，Toll2蛋白確實可以與HMC發(fā)生相互作用。
　　最后，運用病原刺激、實時定量PCR、RNA干擾等實驗技術(shù)分析HMC對Toll2及其信號傳導(dǎo)途徑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙型鏈球菌和副溶血弧菌刺激對蝦后， Toll2與HMC的mRNA表達(dá)變化呈明顯的正相關(guān)性，二者的表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)模式，且二者均在刺激后24h時表達(dá)量達(dá)到最

5、高。進一步研究顯示，對蝦 HMC被干擾后，Toll2及其信號傳導(dǎo)途徑效應(yīng)基因抗菌肽 Penaeidin-4的mRNA表達(dá)水平受到顯著性的影響，其中，乙型鏈球菌刺激對蝦12、24h后，Toll2的mRNA表達(dá)水平分別為 HMC被干擾前的13.6、50.3％，具有極顯著性和顯著性差異。同樣，Penaeidin-4在12、48和72 h時的mRNA表達(dá)水平分別為HMC被干擾前的14.2、32.1和26.3%，具有極顯著性、顯著性和顯著性差異。

6、此外，在副溶血弧菌刺激對蝦后，Toll2和Penaeidin-4的mRNA表達(dá)水平與HMC被干擾前相比，同樣發(fā)生了較大幅度的下降。由此推測，HMC應(yīng)該對Toll2及其信號傳導(dǎo)途徑效應(yīng)基因具有一定的正調(diào)控作用。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn) Toll2蛋白可以與HMC發(fā)生相互作用,且 HMC對Toll2及其信號傳導(dǎo)途徑效應(yīng)基因表現(xiàn)出較好的正調(diào)控作用。所獲研究結(jié)果為深入探索對蝦Toll2的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了良好的基礎(chǔ)，對促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)