法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因序列分析及其表達和調(diào)控機制的研究.pdf

1、先天性心臟病(以下簡稱先心病)是常見的出生缺陷之一，在新生嬰兒中發(fā)病率約6‰～9‰，是1歲以內(nèi)嬰兒死亡的主要原因。WHO資料顯示，全球每年約有150萬先心病患兒出生，其中，我國每年約有15萬～20萬先心病患兒出生。圓錐動脈干畸形是由于胚胎期圓錐動脈干發(fā)育異常所導致的一類紫紺型先心病，約占全部先心病的30％。而其中法洛四聯(lián)癥是最為常見的圓錐動脈干畸形之一，約占先心病的10％。法洛四聯(lián)癥患兒自然預后不佳，若未及時診治則大多在成年期前死亡，即

2、使手術(shù)糾治仍將存在一些殘余問題而影響生活質(zhì)量，給社會和家庭造成較大的經(jīng)濟和精神負擔。因此，對其發(fā)病機制進行研究，對于開展產(chǎn)前咨詢和預后預測等具有重要意義。
　　 作為哺乳動物心臟中最主要的間隙連接蛋白，動物實驗已顯示Connexin43(Cx43)可能是圓錐動脈干畸形遺傳易感性的候選基因，但尚未在人類法洛四聯(lián)癥中得到證實。本研究通過檢測法洛四聯(lián)癥患兒的Cx43基因編碼區(qū)和啟動子序列、右室流出道心肌組織中Cx43蛋白和mRNA的表

3、達水平及其表達調(diào)控機制，探討人類法洛四聯(lián)癥與候選易感基因Cx43的關(guān)系，以及Cx43基因究竟在哪些環(huán)節(jié)上參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病機制。本研究不僅可部分闡明Cx43基因在人類法洛四聯(lián)癥發(fā)病機制中的作用，而且可為其他出生缺陷的研究提供可借鑒的研究思路和研究方法。
　　 第一部分法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)DNA序列分析
　　 目的：
　　 檢測法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)序列變化，分析其在法洛

4、四聯(lián)癥發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 應用PCR技術(shù)以及測序方法，對200例法洛四聯(lián)癥患兒、200例心臟結(jié)構(gòu)正常的健康兒童，對Cx43基因編碼區(qū)和其啟動子區(qū)(上游5’-非編碼區(qū)前2000bp左右)的堿基序列進行測序。對Cx43基因序列變化與法洛四聯(lián)癥的關(guān)系進行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.有2例患兒編碼區(qū)分別存在1個突變位點，分別為c.G455A，c.G716A，均為雜合突變，但未引起氨基酸序列改變

5、。
　　 2.在啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)病例組有4個突變位點，分別為T-153C、T-157C、T-266C和A-1462G，其中T-266C突變存在于2例患兒中，T-153C、T-157C和A-1462G突變分別存在于另3例患兒中。啟動子區(qū)域還存在11個多態(tài)位點，其中4個多態(tài)位點(包括T-1032C、G-1415A、T-1478C、C-1569T)在dbSNP數(shù)據(jù)庫中未查到，可能為中國人群特有的多態(tài)位點，其等位基因和基因型分布在病例組和

6、對照組間無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；另外7個多態(tài)位點分別為C-284T(rs9597379)、A-416C(rs2071166)、G-535A(rs2071165)、G-925C(rs1925223)、A-14086(rs75153918)、G-1431GA(rs73532207)、T-1958C(rs37631741)。其中-1431位點G、A等位基因的分布在兩組間具有統(tǒng)計學差異(X2=0.698，p=0.034)，-1958位點T

7、T/TC/CC基因型分布在兩組間具有統(tǒng)計學差異(p=0.047)。通過生物信息學預測-1431位點下游65bp存在Nkx2-5結(jié)合位點。
　　 小結(jié)：
　　 1.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因編碼區(qū)突變少見
　　 2.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因啟動子區(qū)多個位點突變以及SNP改變可能影響了一些重要轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2-5結(jié)合，從而成為其參與TOF發(fā)病的重要環(huán)節(jié)
　　 第二部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織Cx4

8、3基因的表達研究
　　 目的：
　　 檢測法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因mRNA和蛋白水平表達情況，探討其表達異常在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用。
　　 方法：
　　 選取30例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對象，以10例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對照，應用Real-time PCR和免疫組化的方法檢測Cx43基因在法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中的表

9、達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因mRNA表達明顯高于對照組(p=0.0006)。
　　 2.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因紊亂分布于細胞膜和胞漿，而規(guī)則分布于正常心肌組織細胞閏盤連接處；Cx43蛋白水平表達同樣高于對照組。
　　 小結(jié)：
　　 法洛四聯(lián)癥患兒可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控異常，導致Cx43 mRNA和蛋白水平表達均明顯增高

10、。Cx43異常分布和高表達可能影響了心臟發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細胞遷移以及一些重要信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的信號傳導，導致右室流出道梗阻等表型異常。
　　 第三部分 TOF患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因表達調(diào)控機制的研究
　　 目的：
　　 檢測法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動子和增強子區(qū)甲基化水平、Cx43基因相關(guān)microRNAs表達水平以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平，探討法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因表達

11、增高原因及其參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病的環(huán)節(jié)。
　　 方法：
　　 選取30例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對象，以8例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對照，應用MassARRAY高通量檢測技術(shù)檢測法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動子和增強子甲基化水平，同時應用Luciferase報告基因驗證有差異的甲基化位點的功能；應用Real-time PCR檢測與Cx43基因相關(guān)的10個

12、microRNAs表達水平，同時應用PCR和測序方法對Cx43基因3’UTR區(qū)microRNA結(jié)合位點進行序列分析；應用Real-time PCR檢測Cx43基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因啟動子區(qū)甲基化水平與對照相比無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；第一內(nèi)含子內(nèi)一段增強子區(qū)3個CpG點的甲基化水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.007)。體外實驗證

13、明將含有增強子區(qū)域的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，其Luciferase活性明顯上調(diào)(3.36倍)；而將增強子進行體外甲基化處理后再次轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，其Luciferase活性明顯下調(diào)(60％)。
　　 2.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中miR-1(p=0.0001)、miR-206(p=0.0112)表達明顯低于對照組；而miR-130a、miR-19a、miR-30a、miR-30c、miR-30d和miR-130

14、b表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；miR-30e，miR-144在右室流出道心肌組織中不表達。對法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因3’UTR區(qū)miR-1/miR-206結(jié)合位點進行測序未發(fā)現(xiàn)突變和差異分布的多態(tài)位點。
　　 3.法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中Cx43基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、p53表達水平與對照相比無統(tǒng)計學差異。
　　 小結(jié)：
　　 1.法洛四聯(lián)癥患兒Cx43基因增強子區(qū)存在異常低甲