RXRA在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用機制初步研究.pdf

1、心臟圓錐動脈干畸形是一類導(dǎo)致紫紺和低氧血癥的復(fù)雜先天性心臟病，包括法洛四聯(lián)癥(TOF)、肺動脈閉鎖、大動脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動脈干等多種表型。圓錐動脈干畸形的共同病因被認(rèn)為是流出道的發(fā)育障礙。法洛四聯(lián)癥是最主要的圓錐動脈干畸形，主要表現(xiàn)為右室流出道部分的發(fā)育異常、主動脈騎跨，室間隔缺損和右室肥厚，是造成我國嬰兒和新生兒死亡最主要的原因之一，因此研究其發(fā)病機制，對于開展產(chǎn)前篩查、預(yù)防和干預(yù)具有重要意義。
　　類視黃酸受體alph

2、a(RXRA)是視黃酸(RA)信號通路中的重要受體，RA信號通路已被證實在心臟發(fā)育的多個環(huán)節(jié)包括流出道的發(fā)育發(fā)揮重要作用，提示RXRA在心臟發(fā)育過程中的重要作用。此外，RXRA基因敲除小鼠(Rxrα-/-)可出現(xiàn)圓錐動脈于畸形表現(xiàn)。據(jù)此推測，RXRA可能是TOF的候選致病基因。但目前并未見先天性心臟病患者中RXRA的相關(guān)研究，缺乏有力的人群研究證據(jù)。
　　作為哺乳動物心臟中最主要的間隙連接蛋白，動物實驗已顯示Connexin43(

3、Cx43)可能是圓錐動脈干畸形遺傳易感性的候選基因。本課題組前期在中國法洛四聯(lián)癥患者人群中對Cx43基因進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)法洛四聯(lián)癥患者中Cx43存在異常高表達(dá)。其異常分布和高表達(dá)可能影響了心臟發(fā)育過程中神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移以及一些重要信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致右室流出道梗阻等表型異常。但是法洛四聯(lián)癥患者中Cx43異常高表達(dá)的原因尚不明確。
　　本研究通過檢測法洛四聯(lián)癥患兒的RXRA基因編碼區(qū)和啟動子序列、右室流出道心肌組織中RXR

4、A蛋白和mRNA的表達(dá)水平及其表達(dá)調(diào)控機制，探討人類法洛四聯(lián)癥與候選易感基因RXRA的關(guān)系，并且通過初步探討RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機制中存在的蛋白作用分子機制，闡明RXRA基因究竟在哪些環(huán)節(jié)上參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病機制。
　　第一部分法洛四聯(lián)癥患兒RXRA基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)序列分析
　　目的:
　　對中國TOF患兒中RXRA基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)序列進(jìn)行分析，探討RXRA基因變異與TOF的關(guān)系。

5、　　方法:
　　收集TOF患兒外周血213例及年齡和性別與病例組盡量匹配的健康兒童外周血500例，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄RXRA編碼區(qū)序列、外顯子內(nèi)含子連接處及啟動子區(qū)序列，進(jìn)行測序。對RXRA基因序列變化與TOF的關(guān)系進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.外顯子2及外顯子3各發(fā)現(xiàn)一個未報道的SNP:c.237G/A和c.288A/G。c.237G/A和c.288A/G位點堿基改變未導(dǎo)致氨基酸改變，且基因型頻率和等

6、位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;
　　2.在TOF組RXRA基因外顯子內(nèi)含子連接處共發(fā)現(xiàn)兩個雜合突變，分別為第四外顯子上游5bp處的c.431-5C/T和第八外顯子下游11bp處c.1135+11C/G。上訴兩個突變在兩百例正常兒童中未檢測到。
　　3.在TOF組RXRA基因轉(zhuǎn)錄起始點(TSS)上游1191 bp處檢測出一個雜合突變，即-1191A/G（TSS定為+1）。該突變在五百例正常兒童中未檢測到。在TSS上游12

7、87 bp處檢測出一個雜合突變，即-1287C/T。該突變在五百例正常兒童中檢測到一例。此外，共檢測出兩個新發(fā)SNP，即-800C/A及-760C/T。上訴兩個SNP基因型頻率和等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;通過生物信息學(xué)預(yù)測這四個位點及其附近有多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　小結(jié):
　　1.TOF患兒RXRA基因編碼區(qū)突變少見。
　　2.TOF患兒RXRA基因啟動子區(qū)序列變化可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響RXRA

8、表達(dá)水平從而導(dǎo)致TOF的發(fā)生。
　　第二部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織RXRA基因的表達(dá)研究
　　目的:
　　檢測TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因mRNA和蛋白水平表達(dá)情況，探討其表達(dá)異常在TOF發(fā)病中的作用。
　　方法:
　　選取30例TOF患兒右室流出道心肌組織作為研究對象，以10例非心源性死亡右室流出道心肌組織為對照，分別應(yīng)用Real-time PCR和免疫組化檢測TOF患者和對照組心

9、肌組織中RXRA基因mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.Real-time PCR提示TOF病例組心肌組織中RXRA基因mRNA水平較正常對照組減低。
　　2.免疫組化結(jié)果提示TOF病例組心肌組織中RXRA蛋白水平同樣較正常對照組減低。
　　小結(jié):
　　TOF患兒可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控異常，導(dǎo)致RXRA mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低。
　　第三部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中RXR

10、A基因表達(dá)調(diào)控機制的研究
　　目的:
　　檢測TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因啟動子區(qū)甲基化水平，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制探討TOF患兒RXRA基因表達(dá)降低的原因及其參與TOF發(fā)病的環(huán)節(jié)。
　　方法:
　　選取26例TOF患兒右室流出道心肌組織作為研究對象，以6例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對照，應(yīng)用BSP技術(shù)檢測TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因啟動子甲基化水平，同時應(yīng)用L

11、uciferase報告基因驗證有差異的甲基化位點的功能。
　　結(jié)果:
　　1.TOF患兒RXRA啟動子區(qū)-1000至-1453區(qū)域整體甲基化水平較對照組增高。
　　2.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測RXRA啟動子區(qū)-1000至-1453區(qū)域具有多個轉(zhuǎn)錄因子包括Sp1結(jié)合位點。
　　3.雙熒光素酶實驗結(jié)果提示RXRA啟動子區(qū)-1000至-1453區(qū)域具有增強轉(zhuǎn)錄水平的作用。對PGL3-RXRA-promoter報告基因載體進(jìn)行

12、體外甲基化后再轉(zhuǎn)染，結(jié)果提示其轉(zhuǎn)錄水平較未甲基化者降低。
　　小結(jié):
　　RXRA啟動子區(qū)-1000至-1453區(qū)域包含多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，具有增強轉(zhuǎn)錄水平的作用。TOF患者該區(qū)域DNA甲基化水平增高可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低。
　　第四部分法洛四聯(lián)癥患者中RXRA蛋白和Cx43蛋白的相關(guān)機制研究
　　目的:
　　初步探討RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機制中存在的蛋白作用分子機制

13、。
　　方法:
　　構(gòu)建人類RXRA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)載體，體外共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，利用western blot和免疫熒光技術(shù)檢測RXPA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)變化情況，同時利用Real-time PCR檢測RXRA及Cx43 mRNA表達(dá)變化情況;利用9-cisRA處理HEK293T細(xì)胞，增加其內(nèi)源性RXRA的表達(dá)，同時利用western blot檢測Cx43蛋白表達(dá)變化情況;構(gòu)建RXRA mRNA表達(dá)干擾質(zhì)粒，

14、內(nèi)源性降低RXRA的表達(dá)，同時檢測Cx43蛋白表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.體外共轉(zhuǎn)染RXRA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)載體，western blot和免疫熒光均提示RXRA蛋白會抑制Cx43蛋白表達(dá)，而Real-time PCR提示RXRA蛋白對Cx43蛋白表達(dá)的抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平
　　2.9-cis RA處理HEK293T細(xì)胞后，Cx43蛋白表達(dá)較未處理者降低;
　　3.利用干擾質(zhì)粒抑制RXRA的表達(dá)后，