肺炎克雷伯菌耐藥分析及基intI1在生物被膜中轉(zhuǎn)錄水平研究.pdf

1、目的：肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae，KP)是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，具有較高的耐藥性。了解肺炎克雷伯菌耐藥現(xiàn)狀，為臨床治療提供指導(dǎo)；整合子是一種可以移動(dòng)的基因元件，通過(guò)位點(diǎn)特異的基因重組在臨床細(xì)菌耐藥性傳播中起重要作用。了解Ⅰ類整合子在肺炎克雷伯菌中的分布狀況，分析它在多重耐藥中的作用；細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌附著在有生命或無(wú)生命的材料表面后，由細(xì)菌及其所分泌的胞外多聚物（主要是胞外多糖）共同組成的呈膜狀的細(xì)菌群體

2、。研究表明，生物被膜菌的性質(zhì)與浮游菌有所不同，它可以增加對(duì)抗生素的抵抗能力。肺炎克雷伯菌形成生物膜是其重要的毒力因子，檢測(cè)肺炎克雷伯菌Ⅰ類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)表達(dá)水平的差異，探討整合子的作用機(jī)制。
　　 方法：收集肺炎克雷伯菌共123株，藥敏實(shí)驗(yàn)了解其耐藥情況，設(shè)計(jì)合成Ⅰ類整合酶、Ⅰ類整合子可變區(qū)的上下游引物，煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為模板，整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序，所得序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比

3、對(duì)分析。將Ⅰ類整合酶陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌分別進(jìn)行普通液相培養(yǎng)和生物被膜培養(yǎng)，提取各菌株兩種狀態(tài)下的總RNA。通過(guò)RT-PCR半定量方法，以細(xì)菌的16sRNA為內(nèi)參照，分別測(cè)定整合酶基因在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)下的各自表達(dá)量。
　　 結(jié)果：1．收集的肺炎克雷伯菌株中，經(jīng)過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物抗生素有較高的耐藥率：哌拉西林(100％)、頭孢曲松(76%)、左氧氟沙星(60%)、妥布霉素(60%

4、)、復(fù)方新諾明(63%)，所有菌株均對(duì)美羅培南敏感。
　　 2.Ⅰ類整合酶基因在臨床分離的肺炎克雷伯菌中較為常見(jiàn)，123株細(xì)菌中檢出Ⅰ類整合酶陽(yáng)性菌47株，檢出率為38.2%。Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌株對(duì)8種抗菌藥物的耐藥率與陰性菌株有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2檢驗(yàn)，P＜0.05）。47株整合酶陽(yáng)性菌株，進(jìn)行Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增，其中23株有陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小含680bp，1600bp，2400bp三類。主要為aadA2和dfrA

5、12基因，aadA2基因編碼鏈霉素3’-腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對(duì)鏈霉素和壯觀霉素抗藥性；dfrA12基因編碼蛋白介導(dǎo)甲氧芐氨嘧啶的抗藥性。dfrA12-orfF-aadA2是最常見(jiàn)的基因盒排列方式。
　　 3．試驗(yàn)檢測(cè)到肺炎克雷伯浮游菌和生物被膜菌均有intⅠ1的表達(dá)。菌株在兩種狀態(tài)下intⅠ1mRNA的表達(dá)量不同，生物膜細(xì)菌intⅠ1基因的表達(dá)水平較高。在普通液態(tài)培養(yǎng)組Ⅰ類整合酶基因表達(dá)量為0.08±0.05，而在生物被膜狀態(tài)組

6、Ⅰ類整合酶基因表達(dá)量則為0.28±0.004。生物膜狀態(tài)整合酶基因表達(dá)量約為浮游狀態(tài)的3倍。
　　 結(jié)論：藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)KP臨床菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物抗生素有較高的耐藥率。Ⅰ類整合子在臨床分離的肺炎克雷伯菌株中廣泛存在（整合酶檢出率38.2%），耐藥情況較為嚴(yán)峻（16種抗生素中有9種耐藥率超50%）。整合子中的耐藥基因盒與其抗藥性密切相關(guān)。Ⅰ類整合酶基因在生物被膜狀態(tài)下mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，提示肺炎克