亞胺培南誘導肺炎克雷伯菌產生耐藥及耐藥機制的研究.pdf

1、目的：通過分析亞胺培南誘導肺炎克雷伯菌的耐藥特征探討 AmpC酶和ompK35蛋白在亞胺培南誘導肺炎克雷伯菌耐藥機制中的作用。
　　肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，KPN）是臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一，于1893年從大葉性肺炎患者的肺組織中首次分離到，可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等多種疾病，現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的重要病原菌。由于抗菌藥物的大量使用，使肺炎克雷伯菌的耐藥十分普遍，碳青霉

2、烯類抗生素是治療多重耐藥肺炎克雷伯菌的最強效的抗生素，包括亞胺培南、美洛培南等。然而，隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，全球許多地區(qū)出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌感染的報道，給臨床和治療造成了極大困難。在國內，研究亞胺培南誘導肺炎克雷伯菌耐藥報道的還不是很多，因此本課題有一定的創(chuàng)新性。
　　方法：
　　1、收集標本
　　分離臨床收集肺炎克雷伯菌株共240株。在我院，培養(yǎng)標本主要集中在重癥監(jiān)護病房、神經外科病房、神經內

3、科病房、呼吸科病房，泌尿外科病房等。由于抗生素的大量使用，以上幾個病區(qū)肺炎克雷伯菌的鑒定率和耐藥率都比較高，所以菌株收集主要來源于以上幾個病區(qū)。
　　2、檢測方法及監(jiān)測指標
　　首先采用K-B法測定10種臨床常用抗生素的耐藥情況，所選取的藥物有哌拉西林、亞胺培南、慶大霉素、氨曲南、頭孢他啶、左旋氧氟沙星、阿米卡星、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和多黏菌素B，并提取亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株。其次采用瓊脂稀釋法檢測亞胺培南最低抑菌濃度。

4、然后采用三維實驗的方法分析亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌所產β-內酰胺酶的類型。針對肺炎克雷伯菌株，采用普通 PCR方法檢測 ompK35基因，采用多重 PCR的方法檢測質粒攜帶的 AmpC酶基因，用熒光定量RT-PCR方法檢測 ompK35基因表達情況；同時對產 AmpC酶的肺炎克雷伯菌用 RT-PCR方法檢測AmpC酶基因的表達量情況。
　　3、統(tǒng)計方法
　　所有的數(shù)據(jù)顯示，均數(shù)±標準差。單因素方差分析和 t檢驗進行組間差異

5、分析。當P值小于0.05時，其差異有顯著性。
　　結果：
　　1、針對240株肺炎克雷伯菌，所選取的臨床常用的抗菌藥物有哌拉西林、亞胺培南、慶大霉素、氨曲南、頭孢他啶、左旋氧氟沙星、阿米卡星、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和多黏菌素 B10種藥物進行耐藥實驗，結果顯示肺炎克雷伯菌對這些藥物的耐藥率依次為：39.18％，35.36%，34.45%，32.18%，30.36%、28.72%、27.39%、24.90%，13.72%和0%。<

6、br>　　2、在240株肺炎克雷伯菌株中，共檢測到48株產β-內酰胺酶菌株，β-內酰胺酶的檢出率20.00%(48/240)。其中產AmpC酶的菌株共有25株（52.08%），產金屬酶的菌株有4株（8.33%），產ESBL的菌株有11株（22.92％），同時產AmpC酶和超廣譜β-內酰胺酶的有3株（6.25%）；還有5株菌（10.42％）的產酶類型有待分析。通過三維水解實驗檢測結果發(fā)現(xiàn)，有7株菌所產的AmpC酶對IMP有一定的水解作用。

7、
　　3、 PCR、多重PCR檢測肺炎克雷伯菌IMP耐藥結果顯示，在產AmpC酶的菌株中，AmpC酶的基因含量均有不同程度的增加，其中最少增加4.44倍，最多增加354.59倍。90株IMP耐藥的KP菌株中，ompK35基因檢測為陰性的菌株有40株，占IMP耐藥KP菌株總數(shù)的44.44%(40/90)，陽性菌株有50株，占總數(shù)的55.56%(50/90)。
　　4、在熒光定量RT-PCR對IRKp的ompK35基因表達蛋白量

8、的檢測中，25株產AmpC酶KP菌株中，12株菌ompK35基因表達量減低，13株菌ompK35基因表達量正常；在25株產AmpC酶的KP菌株中微弱水解IMP的菌株有7株，其AmpC酶基因的表達量均有明顯升高，其中5株菌同時伴有ompK35基因表達量降低。
　　結論：
　　1、亞胺培南能誘導肺炎克雷伯菌產生耐藥。
　　2、 AmpC酶的存在是導致KP對IMP耐藥的一個重要因素，其水解活動可能在耐藥機制中起到重要作用。<