肺炎克雷伯菌致病機(jī)制及ICU內(nèi)重要耐藥菌的臨床防控研究.pdf

1、肺炎克雷伯菌是重要的社區(qū)和醫(yī)院獲得性革蘭陰性機(jī)會(huì)致病菌，可以導(dǎo)致患者發(fā)生血流感染、肺炎、肝膿腫及尿路感染等，耐藥及毒力因素是其重要的致病機(jī)制。耐藥方面，碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療產(chǎn)ESBL超廣譜β內(nèi)酰胺酶的最后防線，但是近年來(lái)隨著其在重癥感染中的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌在全球范圍內(nèi)廣泛播散，成為抗感染治療的重大威脅。毒力方面，目前有關(guān)肺炎克雷伯菌尤其是高致病力肺炎克雷伯菌(hvKP)的毒力機(jī)制的研究尚缺乏。研究表明:鐵載體、高黏液

2、表型、表面多糖、莢膜多糖、脂多糖及生物被膜的形成等機(jī)制可能是hvKP毒力增高的重要原因。本課題通過(guò)收集我院臨床分離的碳青霉烯中介或耐藥的肺炎克雷伯菌和高致病力肺炎克雷伯菌，掌握其流行分布狀況，通過(guò)對(duì)耐藥方面的研究，明確碳青霉烯酶的檢出狀況、克隆分布、探索常見(jiàn)耐藥基因的遺傳特征和傳播特點(diǎn)，并從分子水平探討耐藥基因的起源、發(fā)展及擴(kuò)散機(jī)制;毒力方面，明確hvKP菌株重要的毒力基因特點(diǎn)及分子分型，探討hvKP菌株毒力增高的可能機(jī)制;此外，通過(guò)分

3、析重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)肺炎克雷伯菌等重要耐藥致病菌臨床感染特點(diǎn)，評(píng)估降階梯防控耐藥菌交叉感染的防控措施實(shí)施效果。通過(guò)上述研究明確本地區(qū)肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)特點(diǎn)、克隆分布、臨床感染狀況，為臨床肺炎克雷伯菌的防治提供新的依據(jù)。
　　一、肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶的主要類(lèi)型及基因結(jié)構(gòu)分析
　　目的:明確本院肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的檢出狀況、克隆分布、常見(jiàn)耐藥基因的遺傳特征和傳播特點(diǎn)。方法:收集本院對(duì)亞胺培南或美羅培南K-B法抑菌環(huán)≤2

4、2mm的肺炎克雷伯菌株，采用PCR方法擴(kuò)增常見(jiàn)的碳青霉烯酶基因;采用多位點(diǎn)序列分析及脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行分型;通過(guò)質(zhì)粒接合試驗(yàn)明確攜帶耐藥基因的質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性，采用S1酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳、質(zhì)粒電泳及酶切進(jìn)行質(zhì)粒同源性分析;通過(guò)PCR方法擴(kuò)增耐藥基因周?chē)颦h(huán)境，并對(duì)相關(guān)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果:本研究中共收集碳青霉烯耐藥及中介肺炎克雷伯菌株76株，其中76.31％(58/76)的菌株中檢出碳青霉烯酶，48株攜帶blaKPC-2

5、基因，6株攜帶blaIMP-4基因，1株攜帶blaIMP-8基因，其中1株細(xì)菌同時(shí)攜帶blaKPC-2與blaIMP-4基因，2株細(xì)菌攜帶blaNDM-1基因，未檢出攜帶blaOxA-48、blaVIM基因;48株攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌的MLST結(jié)果顯示:43例菌株的MLST分型為ST11，3例為ST15，其余兩例分別為ST43和ST617，另外2例blaNDM-1肺炎克雷伯菌的MLST分型均屬于ST11型;48株攜帶b

6、laKPC-2基因的肺炎克雷伯菌PFGE分型分為(A～L)12種不同的分型，其中16株A1型肺炎克雷伯菌在外科重癥監(jiān)護(hù)病房、急診重癥監(jiān)護(hù)病房及呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)暴發(fā)流行，2例blaNDM-1肺炎克雷伯菌株的PFGE顯示屬于同一克隆的同一亞型;質(zhì)粒接合試驗(yàn)中4例攜帶blaKPC-2基因的質(zhì)粒接合成功，2例攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒接合成功;S1-PFGE實(shí)驗(yàn)及Southern雜交試驗(yàn)顯示不同克隆菌株的blaKPC-2基因位于不同大小的

7、質(zhì)粒上，2例blaNDM-1基因位于大約110Kb的質(zhì)粒上;對(duì)于碳青霉烯酶周?chē)颦h(huán)境分析發(fā)現(xiàn)blaKPC-2基因主要為ISKpn8-blaKPC-2-ISKpn6 like結(jié)構(gòu)，blaNDM-1基因周?chē)Y(jié)構(gòu)為ISCR3-rmtC-ISAba125-blaNDM-1-bleMBL-DsbC-cutA1-GroES-GroEL-insE-ISEhe3。
　　結(jié)論:我院分離的肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的基因型以blaKPC-2為主，ML

8、ST分型主要為ST11型，并首次在上海地區(qū)檢出2例NDM-1陽(yáng)性菌株，耐藥基因容易通過(guò)患者間及醫(yī)療相關(guān)操作造成交叉感染，臨床工作中應(yīng)積極監(jiān)測(cè)并采取有效的防控措施。
　　二、高致病力肺炎克雷伯菌的毒力基因特點(diǎn)和分子流行病學(xué)分析
　　目的:明確本院高致病力肺炎克雷伯菌檢出狀況，毒力基因特點(diǎn)、傳播方式及臨床特點(diǎn)。方法:對(duì)于本院2014年9月至2015年1月臨床標(biāo)本中分離的肺炎克雷伯菌，采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)藥敏進(jìn)行初步評(píng)估，

9、string test實(shí)驗(yàn)對(duì)其黏液表型進(jìn)行評(píng)估;并采用PCR法擴(kuò)增常見(jiàn)的毒力基因K1、K2、RmpA、RmpA2、allS、mrkD、kfuBC、cf29a、fimH、uge、wabG、ureA等基因;采用多位點(diǎn)序列分析及脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法對(duì)肺炎克雷伯菌株進(jìn)行分型。結(jié)果:自2014年9月至2015年1月期間，我院臨床標(biāo)本中共分離到肺炎克雷伯菌455株，共分離到高致病力肺炎克雷伯菌54例，檢出率達(dá)到11.86％。標(biāo)本主要分離自痰液、肝膿腫

10、穿刺液、膽汁分泌物等胃腸道分泌物中，其中3例菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素中介。對(duì)26株hvKP菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示:K1莢膜抗原基因的檢出率為8/26(30.77％)，K2莢膜抗原的檢出率為11/26(42.30％)，黏液表達(dá)基因RmpA2的檢出率為24/26(92.31％)，allS基因的檢出率為7/26(26.92％)，kfuBC基因的檢出率14/26(53.85％)，cf29a基因的檢出率8/26(30.77％)，RmpA、mrk

11、D、fimH、uge、wabG、ureA基因的檢出率均為100％。對(duì)26株高致病力肺炎克雷伯菌的MLST檢測(cè)中共檢出ST23型5例、ST86型4例、ST374型5例、ST375型2例、ST412型5例、ST680型1例、ST11型1例、ST692型1例、2例菌株MLST分型未定義;PFGE分型顯示高致病力肺炎克雷伯菌條帶呈多樣性，與目前臺(tái)灣測(cè)序的NTUH-K2044菌株結(jié)構(gòu)不同。結(jié)論:hvKP菌株在肺炎克雷伯菌的檢出率逐年增高，其MLS

12、T分型和PFGE分型呈多樣性，其高致病力臨床特點(diǎn)及耐藥性不斷增加的現(xiàn)狀值得臨床關(guān)注。
　　三、重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)多重耐藥菌的臨床防控
　　目的:重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)的耐藥菌容易通過(guò)患者及醫(yī)療相關(guān)活動(dòng)造成交叉感染及克隆傳播，本研究通過(guò)實(shí)施降階梯分級(jí)防控策略來(lái)有效降低耐藥菌的交叉感染，以期減少耐藥菌定植與感染，改善患者預(yù)后。方法:本研究采用前后對(duì)比、干預(yù)對(duì)照研究方法，對(duì)2013年8月至2014年7月期間外科監(jiān)護(hù)病房(SICU)連續(xù)收治的危

13、重患者進(jìn)行主動(dòng)性、多部位耐藥菌篩查。其中在2014年2月至2014年7月期間在SICU實(shí)施組合式降階梯防控策略。結(jié)果:本研究期間SICU共入住患者184例，對(duì)照組和干預(yù)組各92例。對(duì)照組檢出多重耐藥菌69例，干預(yù)組41例;兩組患者多重耐藥菌株檢出率分別為75％和44.57％，p＜0.001;其中兩組患者ICU內(nèi)獲得性多重耐藥菌株分別為55和26株，ICU內(nèi)多重耐藥菌株檢出率分別為59.78％和28.26％，p＜0.001;對(duì)照組和干預(yù)組

14、的ICU獲得性多重耐藥菌感染千日率分別為14.12‰和7.64‰，p=0.16; ICU獲得性多重耐藥菌血流感染千日率分別為3.14‰和0.69‰，p=0.45; ICU獲得性多重耐藥菌肺炎感染千日率分別為6.28‰和1.39‰，p=0.16; ICU獲得性多重耐藥菌腹腔感染千日率分別為4.18‰和2.78‰，p=0.88;干預(yù)組患者多重耐藥菌感染歸因死亡率低于對(duì)照組(5.43‰VS13.04‰，p=0.07)。結(jié)論實(shí)施降階梯防控措施能