肺炎克雷伯菌耐藥質(zhì)粒pKF3-147序列的測定及分析.pdf

1、目的：本實驗作為本研究所研究課題的一部分，主要研究了臨床上常見也是很重要的菌株肺炎克雷伯菌的耐藥質(zhì)粒。細菌耐藥性的改變，大多與細菌所攜帶的基因有關(guān)，而這些基因往往位于耐藥菌所攜帶的質(zhì)粒上，可通過質(zhì)粒或質(zhì)粒所攜帶的可移動元件在細菌群體中播散。因此我們有必要通過對質(zhì)粒DNA序列的測定，分析質(zhì)粒所攜帶的功能基因，從基因組水平研究肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒與宿主菌的耐藥性和致病性等的關(guān)系，為進一步分析肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的演變規(guī)律

2、和分子進化，以及肺炎克雷伯菌的耐藥性和致病性機理的研究打下基礎。 方法：本課題從溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床分離的一株多重耐藥肺炎克雷伯菌作為本實驗菌株來源。首先，確定臨床來源的多重耐藥的肺炎克雷伯菌，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，構(gòu)建小片段pUC18文庫和大片段的fosmid文庫，并測序。再采用Phred/Phrap/Consed軟件包進行序列拼接，獲得質(zhì)粒全序列。然后進行質(zhì)粒DNA的ORF查找(Glimmer3軟件)和功能注釋，

3、BLAST比較蛋白數(shù)據(jù)庫(Pfam，InterPro，NCBI庫)和COGs，確定蛋白家族，多序列比對使用ClustalW。進一步對這些基因進行功能分析，并在基因組水平上研究肺炎克雷伯菌質(zhì)粒耐藥性的傳播、演變規(guī)律及分子進化機制。 結(jié)果：通過上述實驗，得到如下結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了一個包含所有質(zhì)粒DNA的插入片段大小為2-3Kb的pUC18文庫，和35-40Kb的。fosmid文庫。 2.測序拼接后得到3個環(huán)狀雙鏈

4、DNA質(zhì)粒：pKF3-70(69477bp)、pKF3-90(91327bp)和pKF3-147(147415bp)。 3.其中對質(zhì)粒pKF3-147DNA分析表明，質(zhì)粒pKF3-147DNA全基因組序列大小為147，415bp，為一個環(huán)狀質(zhì)粒，共編碼177個ORF，G+C平均百分含量為52.5％，ORF的平均長度為688bp，編碼基因序列占整個基因組的82.6％。在預測的ORF中，有105個ORF(59.3％)編碼的基因在已知

5、數(shù)據(jù)庫能找到已知功能的同源基因，能夠賦予功能，18個ORF(10.2％)編碼保守的假定蛋白，剩余54個(30.5％)在已知數(shù)據(jù)庫里沒有同源蛋白基因序列。 4.質(zhì)粒pKF3-147DNA存在編碼毒力相關(guān)基因、接合轉(zhuǎn)移功能基因、抗藥基因和其它功能基因，包括aac(抗氨基糖苷類藥物，ORF0106)，dhfr(甲氧芐啶磺胺類，ORF135)，aph(氨基糖苷類藥物，ORF125)，sulⅠ、sulⅡ(磺胺類藥物，ORF132，ORF1

6、222)，str(鏈霉素，ORF120，ORF121)和aadA4(鏈霉素，ORF134)，tetRA(四環(huán)素，ORF118，ORF119)和qac(季銨化合物，ORF133)。其中ORF132-ORF135是一個Ⅰ類整合子基因盒。 結(jié)論：以上研究表明： 1.本實驗成功地分離并測序分析了臨床重要病原菌肺炎克雷伯菌的耐藥質(zhì)粒DNA全序列。 2.質(zhì)粒pKF3-147DNA存在編碼接合轉(zhuǎn)移功能基因、抗藥基因和其它功能基