肺炎克雷伯菌耐藥質(zhì)粒pKF3-70和pKF3-90序列的測定及分析.pdf

1、[目的]： 1.本研究主要從基因組水平研究臨床主要病原菌-肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)； 2.進一步分析質(zhì)粒所攜帶的功能基因，研究質(zhì)粒與宿主菌的耐藥性和致病性等的關(guān)系； 3.為以后分析肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒譜、質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的演變規(guī)律和分子進化打下基礎。 [方法]： 1.參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，并經(jīng)法國生物梅里埃公司(bioMerieux)Vitek60細菌鑒定儀鑒定，我們從溫州醫(yī)學院附屬第一

2、醫(yī)院臨床送檢的血液、腹水、尿液等體液中分離得到2006年2月-8月24株肺炎克雷伯菌。 2.采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，電泳分析細菌的質(zhì)粒譜，選取含大質(zhì)粒多重耐藥性菌株為待研究菌株。 3.大量提取選定菌株的質(zhì)粒DNA；構(gòu)建質(zhì)?；蚪M小片段文庫FOESMID文庫并測序。 4.采用美國華盛頓大學提供的Phred/Phrap/Consed軟件包進行序列拼接，然后用美國TIGR研究所提供的Gliminer軟件預測ORF，

3、進一步對這些基因進行功能分析。 5.利用Blast軟件進行序列同源性比較、Clustal軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。 [結(jié)果]： 1.成功構(gòu)建了一個包含所有質(zhì)粒DNA的大小為2-3kb的pUC18文庫和35-40kb片段大小的FORSMID文庫。 2.測序拼接后得到3個環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒：其中pKF3-70的大小為69，477bp，G+C平均百分含量為52.4％，預測共編碼92個ORFs，編碼序列占整個基因組

4、的78.3％，在這92個ORFs中73.9％在已知數(shù)據(jù)庫中有同源基因，能夠賦予功能，15.2％的ORFs編碼保守的假定蛋白，剩余10.7％的ORFs在已數(shù)據(jù)庫里沒有同源蛋白序列。pKF3-90測序大小為91，327bp，預測共編碼114個ORFs，G+C平均百分含量為51.9％，編碼序列占整個基因組的85.2％。預測的編碼ORFs中，有49.1％ORFs在已知數(shù)據(jù)庫中有同源基因，能夠賦予功能，45.6％ORFs編碼保守的假定蛋白，剩余5

5、.3％ORFs在已數(shù)據(jù)庫里沒有同源蛋白序列。 3.在pKF3-70和pKF3-90上同時發(fā)現(xiàn)了耐藥性基因(β-內(nèi)酰胺酶)、和接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)基因、可移動DNA元件等。其中pKF3-70編碼了毒力相關(guān)基因(鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)透過性酶基因等)，pKF3-90編碼了毒力相關(guān)基因(hok基因、溶血素調(diào)控蛋白基因等)。 [結(jié)論]： 1.本文成功地分離并測序分析了臨床重要病原菌肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒DNA全序列。 2.在這兩個質(zhì)粒上

6、都出現(xiàn)有未知功能的蛋白，特別是在pKF3-90上有50.9％的編碼蛋白是未知的，有可能是該細菌特有的蛋白，其功能還有待與我們進一步的研究。 3.在這2個質(zhì)粒上都有編碼一整套F質(zhì)粒相關(guān)的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)基因(F-tra系統(tǒng)基因)，表明這2個大質(zhì)?？稍诓煌N或菌株中進行接合轉(zhuǎn)移。 4.這2個質(zhì)粒都編碼耐藥性相關(guān)基因和毒力相關(guān)基因等，由于這2個質(zhì)粒都是可接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，可以將耐藥基因在細菌間進行基因水平轉(zhuǎn)移，這樣造成了耐藥菌的播散