一、GFRα2基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定二、乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的建立及功能驗(yàn)證.pdf

1、第一部分:GFRα2基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定
　　目的:構(gòu)建膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體α2基因（GlialCellLine-derived Neurotrophic Factor Receptor2，GFRα2）過(guò)表達(dá)慢病毒載體(Lentiviral vector，LV)，并對(duì)其進(jìn)行病毒包裝與鑒定，為進(jìn)行GFRα2基因體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法: GenBank搜索GFRα2基因序列(Gene ID:2675，

2、序列號(hào):NM_001495)，設(shè)計(jì)PCR(Real-time PCR)引物擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建至過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。成功進(jìn)行驗(yàn)證后，使其與慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞293T，并包裝為慢病毒，待濃縮純化后檢測(cè)其滴度。
　　結(jié)果:測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列相一致，PCR鑒定產(chǎn)物大小1536bp，和預(yù)期值大小相同，Western blotting技術(shù)檢測(cè)觀察到55KD附近處有特征條帶，且與目的基因融合蛋白大小一致

3、，結(jié)果證實(shí)GFRα2正確插入到載體中，且過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。感染人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到熒光表達(dá)，收集病毒上清液，熒光法測(cè)定病毒的包裝滴度為2.0×108TU/ml。
　　結(jié)論:GFRα2基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功，為研究其在乳腺癌內(nèi)分泌治療的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的建立與功能驗(yàn)證
　　目的:構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞系MCF-7他莫昔芬耐藥細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)

4、證，探索GFRα2及HER2表達(dá)情況與其耐藥性的關(guān)系。
　　方法:1、4-OH他莫昔芬(OHT)誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，顯微鏡下觀察比較不同誘導(dǎo)時(shí)間細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異，制作生長(zhǎng)曲線，比較細(xì)胞生長(zhǎng)差異。2、CCK8試劑盒檢測(cè)藥物敏感試驗(yàn)。計(jì)算不同誘導(dǎo)時(shí)間細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50及耐藥指數(shù)（RI）。3、細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn)比較MCF-7細(xì)胞、OHT誘導(dǎo)第14天（MCF-714d）及第28天(MCF-728d)侵襲遷移能力。4、RT-PCR

5、檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間細(xì)胞的GFRα2 mRNA及HER2 mRNA表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)GFRα2、HER2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、MCF-7細(xì)胞呈鋪路石樣團(tuán)簇生長(zhǎng)團(tuán)，形態(tài)呈橢圓形，體積中等，大小均勻，核仁清晰;使用OHT誘導(dǎo)7天，細(xì)胞團(tuán)簇樣生長(zhǎng)開(kāi)始趨于松散，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)變化，由圓形、橢圓形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾切?、多角?誘導(dǎo)第14天，細(xì)胞松散，團(tuán)簇樣生長(zhǎng)不明顯，細(xì)胞形態(tài)明顯變化，呈星形、多角形、樹(shù)枝樣;

6、誘導(dǎo)28天后，細(xì)胞團(tuán)簇樣生長(zhǎng)不明顯，形態(tài)較扁平，以尖角形或多角形為主，排列無(wú)規(guī)則，體積較大，核仁大且明顯，胞質(zhì)內(nèi)雜志較多。
　　2、MCF-7親本細(xì)胞，4-OHT誘導(dǎo)14d、28d各組之間細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化，增殖能力與MCF-7細(xì)胞相似。
　　3、隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，不同濃度的4-OHT作用下的各組細(xì)胞的抑制率均逐漸降低，而IC50和RI均逐漸增高。其中，在誘導(dǎo)第14天時(shí)，獲得的細(xì)胞株MCF-714d的IC50、RI達(dá)到

7、最高值，并顯著高于MCF-7細(xì)胞株，說(shuō)明其耐藥性最高。但隨著4-OHT誘導(dǎo)時(shí)間分別延長(zhǎng)至21天和28天時(shí)，獲得的細(xì)胞株MCF-721d和MCF-728d的IC50和RI均較MCF-714d細(xì)胞降低，其中誘導(dǎo)至28天時(shí)，細(xì)胞的IC50趨于穩(wěn)定。
　　不同濃度OHT對(duì)各組細(xì)胞株的抑制率存在差異，其中OHT的濃度為10-4 mol/L時(shí)，對(duì)各組細(xì)胞株的抑制率均最高，而濃度為10-8 mol/L時(shí)抑制率最低，并且在濃度為10-8mol/L

8、時(shí)，OHT對(duì)MCF-728d細(xì)胞無(wú)抑制作用。
　　4、MCF-728d組的遷移細(xì)胞數(shù)較另兩組細(xì)胞均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明MCF-728d組細(xì)胞侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)。
　　5、使用OHT誘導(dǎo)MCF-7第7天時(shí)，獲得的細(xì)胞MCF-77d的GFRα2mRNA和HER2 mRNA表達(dá)量較MCF-7細(xì)胞低;誘導(dǎo)至第14天時(shí)，MCF-714d細(xì)胞中兩者表達(dá)水平均明顯增高，與親本MCF-7細(xì)胞相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

9、0.05)。誘導(dǎo)第21天時(shí)，兩者表達(dá)水平不再增高，反而下降。28天時(shí)，MCF-728d細(xì)胞的GFRα2 mRNA表達(dá)量仍較MCF-7高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但其HER2 mRNA表達(dá)卻較MCF-7明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用Western blot檢測(cè)MCF-714d細(xì)胞的GFRα2和HER2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示， GFRα2及HER2均有明顯條帶顯示，表明細(xì)胞中GFRα2和HER2蛋白有表達(dá)。

10、>　　結(jié)論:采用高濃度短時(shí)間OHT他莫昔芬沖擊法誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，在誘導(dǎo)至第14天時(shí)成功構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥細(xì)胞株MCF-714d。與其他誘導(dǎo)時(shí)間的乳腺癌細(xì)胞株比較，使用CCK8試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明，該耐藥細(xì)胞株的耐藥指數(shù)最大，耐藥性最強(qiáng);而RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，該耐藥細(xì)胞株中GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表達(dá)量最高。提示GFRα2 mRNA和HER2 mRNA表達(dá)狀況與MCF-7細(xì)胞的他莫昔芬耐藥有關(guān)，兩者