PAX2、AIB1在人乳腺癌細胞生長及他莫昔芬治療作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，嚴重危害著女性的生命和健康。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，且發(fā)病年齡呈年輕化。乳腺癌是內分泌依賴性腫瘤，雌激素會刺激乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，并增加乳腺癌的復發(fā)和轉移的機率。相比于細胞毒性藥物治療，內分泌治療具有其副作用小、方便服用、效應持久，對患者生活質量影響小等優(yōu)點，成為乳腺癌最重要的治療手段之一。他莫昔芬（三苯氧胺，tamoxifen TAM）是一種選擇性雌激素受體調變劑，用于絕經

2、前雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性的乳腺癌患者的內分泌治療。目前臨床上約40％～50％ ER陽性的乳腺癌患者對抗雌激素治療產生耐藥。但TAM耐藥機制尚不明確，ER的丟失和變異并不能完全解釋TAM抵抗。
　　本課題的前期研究發(fā)現，抗雌激素藥物——他莫昔芬調節(jié)CerbB-2基因表達，繼而調節(jié)乳腺腫瘤細胞生長。在此過程中，有兩個基因:PAX2（配對盒基因，Paired box gene）及AIB-1（Ampl

3、ified in breast cancer1，又稱SRC-3）起到很重要的介導作用。研究發(fā)現PAX-2與AIB-1競爭性結合ER受體以調控HER-2的轉錄，從而決定他莫昔芬對乳腺癌內分泌治療的有效性。鑒于此，本文對PAX2和AIB1在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞生長及他莫昔芬耐藥中的作用進行了較為系統(tǒng)的實驗研究。
　　方法:
　　1、PAX-2、AIB-1基因重組質粒穩(wěn)定轉染MCF-7細胞株的建立
　　1.1細胞穩(wěn)定轉

4、染:將PAX-2、AIB-1基因的重組質粒(EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1))大量提純。通過脂質體介導的方法將質粒轉染入人乳腺癌MCF-7細胞，經嘌呤霉素加壓篩選4-5周，分別得到穩(wěn)定高表達PAX-2、AIB-1基因的新乳腺癌細胞株(命名為MCF-7-PAX-2、MCF-7-AIB-1)。設立陰性質粒[EX-NEG-M90（空載）]穩(wěn)定轉染的MCF-7細胞株為對照（命名為MCF-7-空載）。

5、通過綠色熒光蛋白GFP檢測細胞轉染效率。
　　1.2穩(wěn)定轉染細胞株的驗證:實驗分組:未處理組（MCF-7細胞）;空載組（MCF-7-空載）;對照組1(MCF-7-AIB1);對照組2(MCF-7-PAX2)。采用RT-PCR、Western blot方法分別檢測四組細胞株PAX2mRNA、AIB1mRNA及PAX2、AIB1蛋白表達量，以驗證獲得的細胞株為穩(wěn)定轉染細胞株。
　　2、穩(wěn)定轉染后細胞的體內增殖能力及耐藥性的研究<

6、br>　　2.1穩(wěn)定轉染細胞荷瘤裸鼠模型的建立和腫瘤體積的測量將穩(wěn)定轉染細胞制備成單細胞懸液，于裸鼠于右側背部皮下注射細胞懸液，使接種細胞總數為1.5×107個/只。接種后觀察到腫瘤生長，按公式計算腫瘤體積(Tumor Volume) TV=1/2×LW2。待接種7周后給予他莫昔芬灌胃，觀察處理后腫瘤生長情況。
　　2.2裸鼠成瘤標本檢測
　　接種12周后處死小鼠，取出皮下腫瘤，HE染色結果證實為接種瘤。同時，提取裸鼠腫瘤組

7、織總RNA和總蛋白，進行Western Blot和Real time PCR檢測PAX2、AIB1、HER2及增殖相關因子ki-67的表達情況。應用免疫組化對PAX2、AIB1、HER-2、ki-67特異性表達情況進行檢測。
　　3、統(tǒng)計學分析
　　每組實驗不少于3次獨立樣本的重復，采用SPSS軟件(13.0)進行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)和非參數檢驗，數據用均數±標準差表示，檢驗

8、以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結果:
　　1、質粒提純情況
　　①提純的EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90（空載）質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約與目的大小一致的條帶。
　?、谧贤夥止夤舛葍x法測定EX-Z4450-M90（PAX-2）、EX-Z5301-M90（AIB-1）、EX-NEG-M90（空載）質粒濃度分別為684μg/ml，OD2

9、60/OD280值為1.956;598μg/ml，OD260/OD280值為1.942;962μg/ml，OD260/OD280值為1.959。質粒提純成功，純度高，濃度高，可用于細胞轉染。
　?、厶峒冑|粒進行檢測，質粒所測部分堿基序列無錯誤。
　　2、轉染效率
　　通過綠色熒光蛋白GFP檢測，MCF-7-PAX-2細胞、MCF-7-AIB-1細胞、MCF-7-空載細胞轉染效率均達80％左右。
　　3、穩(wěn)轉株PA

10、X2、AIB1基因mRNA表達情況
　　RT-PCR結果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2細胞PAX-2mRNA明顯升高，升高至321.08倍(P＜0.05);AIB-1 mRNA無明顯變化。MCF-7-AIB-1細胞AIB-1 mRNA明顯升高，599.665倍(P＜0.05); PAX-2mRNA無明顯變化。MCF-7-空載細胞PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA均無明顯變化。
　　4、穩(wěn)轉株PAX2、AI

11、B1蛋白表達情況
　　Western blot結果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2細胞PAX-2蛋白相對表達量為1.677±0.346，明顯升高，升高了67.7％(P＜0.05); AIB-1蛋白相對表達量為1.162±0.145，無明顯變化。MCF-7-AIB-1細胞AIB-1蛋白相對表達量為2.446±1.207，明顯升高，升高了144.56％(P＜0.05);PAX-2蛋白相對表達量為1.059±0.030，無明

12、顯變化。MCF-7-空載細胞PAX-2蛋白相對表達量為1.035±0.040，AIB-1蛋白相對表達量為1.172±0.258均無明顯變化(P＞0.05)。
　　5、瘤體積測量結果:
　?、俳臃N3周后四組小鼠均形成腫瘤。
　　②接種5周后，各組間瘤體積即出現明顯區(qū)別。與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤明顯小于未處理組，瘤體積小于7.36％（P＜0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤明顯大于未處理組，瘤體積大

13、于13.09％（P＜0.05）;而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性(P＞0.05)。
　　③接種7周后，與未處理組相比， MCF-7-PAX-2組腫瘤體積為876.76±48.11，明顯小于未處理組，瘤體積小于15.69％（P＜0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤體積為1596.99±64.97，明顯大于未處理組，瘤體積大于53.57％（P＜0.05）;而MCF-7-空載組腫瘤體積為1101.99±93.3，與未處

14、理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　④他莫昔芬灌胃5周后，與處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤生長速度明顯小于未處理組，27.5％(P＜0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤生長速度明顯大于未處理組，125.75％(P＜0.05);而MCF-7-空載組和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　6、接種瘤HE和免疫組化結果:
　?、貶E染色觀察實驗組和未處理組細胞形成的皮下腫瘤組織惡性程度無明顯差

15、異，均可見高分裂像，瘤細胞排列密集形狀近于卵圓形或多邊形。
　?、诿庖呓M化顯示，四組腫瘤PAX-2、AIB-1、HER-2、ki-67均為陽性。與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2強陽性表達率高(P＜0.05)，HER2強陽性表達率低(p＜0.05)，AIB-1、Ki-67均無顯著差異(P＞0.05);MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1強陽性表達率高(p＜0.05)，HER2、PAX-2、ki-67均無顯著差

16、異（P＞0.05）;而MCF-7-空載細胞和未處理組相比差異無顯著性P＞0.05）。
　　7、接種瘤RT-PCR結果顯示:與未處理組相比， MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2mRNA明顯升高，升高13315.24％(P＜0.05)，AIB-1mRNA、HER2mRNA顯著降低，分別降低67.16％、54.63％(P＞0.05); MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1 mRNA、HER2mRNA明顯升高，分別升高5801.77

17、％、538.49％(P＜0.05)，PAX-2mRNA顯著降低，降低28.9％（P＞0.05）;MCF-7-空載組腫瘤PAX-2mRNA、AIB-1 mRNA、HER2mRNA和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　8、接種瘤Western blot結果顯示:與未處理組相比，MCF-7-PAX-2組腫瘤PAX-2陽性表達率升高91.06％（P＜0.05），AIB-1、HER2陽性表達率分別降低33.86％、38.65％（

18、P＜0.05），Ki-67均無顯著差異（P＞0.05）;MCF-7-AIB-1組腫瘤AIB-1、HER2陽性表達率分別升高256.71％、270.23％（P＜0.05），PAX-2陽性表達率降低71.72％（P＜0.05），Ki-67無顯著差異（P＞0.05）;MCF-7-空載腫瘤組PAX-2、AIB-1、HER2表達情況和未處理組相比差異無顯著性（P＞0.05）。
　　結論:
　　1、AIB-1高表達可促進ER陽性乳腺癌M

19、CF-7細胞在體內的生長，PAX-2高表達可抑制MCF-7細胞在體內的生長。
　　2、AIB-1高表達可導致ER陽性乳腺癌MCF-7細胞對于TAM的敏感性降低，PAX-2高表達可促進MCF-7細胞對于TAM的藥物敏感性。
　　3、AIB-1高表達可促進HER-2的表達，PAX-2高表達可抑制HER-2的表達。
　　4、AIB-1高表達或PAX-2高表達均不影響ki-67的表達。
　　5、PAX-2高表達及AIB-