GPER介導他莫昔芬對人乳腺癌相關(guān)成纖維細胞的增殖、遷移及凋亡作用.pdf

1、目的：通過構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER）的慢病毒短發(fā)夾RNA（shRNA）表達載體，探討GPER介導他莫昔芬（tamoxifen，TAM）對人乳腺癌相關(guān)成纖維細胞（Cancer-associated fibroblast, CAF）的細胞增殖、遷移與凋亡作用1。
　　方法：1.設(shè)計4條長度為19 bp的針對GPER基因shRNA的寡核苷酸序列及陰性對照序列，合成相應的siRNA序列。將GV115載體用Age I和EcoR I

2、行雙酶切，將酶切產(chǎn)物和合成的成對的寡鏈氨基酸退火形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)混合，通過T4 DNA連接酶連接，用大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化后挑取轉(zhuǎn)化子，使用GV115載體通用引物，進行菌落PCR及測序鑒定，在HEK293T細胞中包裝病毒及測定病毒滴度。通過實時定量PCR進行內(nèi)源性篩靶，選取干擾效果最佳的病毒進行后續(xù)實驗， Western blot法檢測慢病毒在靶細胞的蛋白表達。
　　2.將CAF細胞分為4組，NC(negative contro

3、l,NC)組、GPER-RNAi、NC聯(lián)合TAM組和GPER-RNAi聯(lián)合TAM組，CCK-8檢測法、流式細胞術(shù)及Transwell實驗檢測經(jīng)他莫昔芬處理后各組CAF細胞的增殖、遷移及凋亡能力。
　　結(jié)果：1.Lenti-GPER-siRNA慢病毒載體經(jīng)HEK293T細胞包裝成功， Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入病毒后GPER在CAF細胞中的表達較NC組顯著降低（P<0.05）。
　　2.流式細胞術(shù)及CCK-8試劑盒檢

4、測細胞增殖情況。各組PI分別為(30.76±7.4)％，(32.54±3.5)%，(43.61±4.4)%(P=0)，(34.93±6.8)%。TAM處理72h后，NC聯(lián)合TAM組細胞數(shù)增加至NC組的(172.16±10.8)%(P=0)。GPER-RNAi組細胞數(shù)為NC組的(92.73±7.1%(P=0.10)， GPER-RNAi聯(lián)合 TAM組(96.58±4.2)%(P=0.43)。流式細胞術(shù)檢測 NC組、GPER-RNAi組、N

5、C聯(lián)合TAM組和GPER-RNAi聯(lián)合NC組細胞凋亡比率分別為：(29.10±1.4)%、(28.27±1.3)%、(9.62±0.91)%、(31.09±1.2)%。GPER-RNAi組細胞凋亡比率與NC組無明顯差異P>0.05，。NC聯(lián)合TAM組凋亡低于對照組(P<0.05)。Transwell實驗提示加入TAM后， CAF遷移細胞數(shù)明顯增加(遷移細胞數(shù)由40.75±3.59個增加至99.50±4.80個)，而GPER-RNAi聯(lián)合