血脂康對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎的治療潛能.pdf

1、目的：
　　格林巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS），又稱急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，是常見的脊神經(jīng)和周圍神經(jīng)的脫髓鞘疾病，是一種神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制為分子模擬理論，即外源性感染因子上存在與正常組織成分結(jié)構(gòu)相同或相近的共同抗原表位，抗感染免疫去除感染因子的同時(shí)產(chǎn)生自身抗體，損害神經(jīng)組織。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(Experimental autoimmuneneuritis，EAN)

2、是一種主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的，累及外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheralnervous system，PNS)的急性炎癥性脫髓鞘性疾病，其在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)病理學(xué)改變及電生理等諸多方面，同人類GBS極為相似，因此已被國(guó)際上公認(rèn)為研究GBS的理想動(dòng)物模型。應(yīng)用周圍神經(jīng)髓鞘蛋白或其組成成分P2或P0蛋白或其肽與完全弗氏佐劑共同免疫敏感動(dòng)物可成功誘導(dǎo)EAN模型。體液免疫和細(xì)胞免疫均參與其發(fā)病機(jī)制。
　　血脂康膠囊是由特制紅曲發(fā)酵

3、而成，含13種天然莫納可林(Monacolin)，為他汀同系物，發(fā)揮調(diào)脂作用。其主要成分為洛伐他汀，還含有多種不飽和脂肪酸以及必需氨基酸，但其對(duì)HMG-CoA還原酶活性的抑制優(yōu)于洛伐他汀。他汀類藥物是3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的抑制劑，通過(guò)阻斷甲羥戊酸途徑抑制膽固醇的合成，臨床上主要用于降低低密度脂蛋白。目前越來(lái)越多的研究集中于他汀類藥物與自身免疫病間的關(guān)系，如多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過(guò)抑

4、制Th1和Th17免疫反應(yīng)，下調(diào)細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)并上調(diào)淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例從而緩解了EAN病情。而阿托伐他汀修飾的樹突狀細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)重癥肌無(wú)力大鼠免疫耐受，其機(jī)制包括增加了CD4+CD25+Treg的比例及Foxp3的表達(dá)、抑制淋巴細(xì)胞增生、誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌的Th1/Th17型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化以及減弱血清中抗R97-116肽IgG抗體的產(chǎn)生。
　　然而血脂康作為傳統(tǒng)降脂中藥，其所含成分雖含他汀

5、卻又與他汀類藥物不盡相同。本研究通過(guò)構(gòu)造實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎動(dòng)物模型，闡明血脂康誘導(dǎo)EAN免疫耐受的機(jī)制，為臨床應(yīng)用血脂康治療GBS提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.1.材料
　　1.1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性Lewis大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量155～185 g。
　　1.1.2.主要試劑:抗原為周圍髓鞘蛋白(P0)抗原180～199肽段。
　　1.2.實(shí)驗(yàn)方法
　　1.2.1.EAN模型的誘導(dǎo)

6、及臨床評(píng)分
　　于每只大鼠雙后足墊皮下給予200μL抗原乳液（含200μg P0180-199肽，1.5mg H37Ra結(jié)核桿菌，不完全弗氏佐劑），每側(cè)100μL，免疫當(dāng)天記為第0天。采用雙盲評(píng)估法，自免疫當(dāng)天開始每天評(píng)測(cè)大鼠臨床癥狀并記錄體質(zhì)量，至免疫后第16天（臨床癥狀達(dá)高峰時(shí)）。臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí):正常;1級(jí):尾部無(wú)力;2級(jí):輕度后肢癱瘓;3級(jí):中度后肢癱瘓;4級(jí):重度后肢癱瘓5級(jí):四肢癱。以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均數(shù)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7、
　　1.2.2.血脂康治療EAN
　　15只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、小劑量治療組(200 mg/kg/day)和大劑量治療組(1000 mg/kg/day)。自免疫后第五天開始每天給予血脂康灌胃治療，直至免疫后第16天。對(duì)照組給予等體積的0.9％生理鹽水灌胃處理。
　　1.2.3淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備
　　免疫后第16天麻醉大鼠，無(wú)菌條件下取雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)制備淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞懸液。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2

8、×106個(gè)/mL。
　　1.2.4.胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)
　　取淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞懸液，分別加入PE標(biāo)記的抗大鼠IL-10和TNF-α及FITC標(biāo)記的IL-17A和IFN-γ抗體，避光，于4℃環(huán)境下孵育30 min后重懸上機(jī)檢測(cè)。
　　1.2.5.流式檢測(cè)Treg細(xì)胞情況
　　取淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的CD25抗體，4℃下孵育30 min。洗滌后加入固定/破膜工作液并混勻，4℃

9、下避光孵育過(guò)夜。洗滌細(xì)胞后加入PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體，4℃孵育30 min。細(xì)胞重懸過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。
　　1.3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用spss22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用單因素方差分析(one-factor analysis of variance，ANOVA)比較3組標(biāo)本的組間差異，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.血脂康治療組臨床評(píng)分降低
　　2.血脂