阿托伐他汀修飾的樹突狀細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎的治療研究.pdf

1、研究背景:人類格林-巴利綜合征(GBS)是引起神經(jīng)肌肉麻痹的普遍原因，而急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(AIDP)，其最常見的類型，為一種自身免疫性疾病，臨床上主要累及外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)，而發(fā)病機(jī)制主要由CD4+T細(xì)胞參與介導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)是公認(rèn)的研究人類AIDP的動物模型，在易感動物中，通過外周神經(jīng)系統(tǒng)中同種抗原的免疫（如BPM、P0等）可以誘導(dǎo)EAN的發(fā)生。
　　樹突狀細(xì)胞(DCs)是經(jīng)典的抗原遞呈細(xì)胞

2、，能夠啟動和調(diào)控免疫反應(yīng)，與活化的DCs相比，未成熟的DCs，特征是其表面共刺激分子如CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子下調(diào)，在免疫調(diào)節(jié)中通過多種效應(yīng)機(jī)制起作用，而且，它能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的低反應(yīng)性，這種現(xiàn)象已經(jīng)被人們用于控制某些自身免疫性疾病的研究，比如說1型糖尿病(type-Ⅰdiabetes)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)。近二十年間，研究者們嘗試用不同的方式創(chuàng)造能夠誘導(dǎo)免疫耐受的DCs，統(tǒng)稱為“耐受性DCs”，這些研究大都應(yīng)用于動物模型，包

3、括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)等。
　　在體外修飾產(chǎn)生耐受性DCs的方式很多，最常見有效的是應(yīng)用免疫抑制劑，例如應(yīng)用IL-10，TGF-β等，而利用免疫抑制藥物對DC功能進(jìn)行藥理調(diào)節(jié)進(jìn)而誘導(dǎo)耐受性DCs產(chǎn)生的方式也做過廣泛研究。包括阿托伐他汀在內(nèi)的他汀類藥物，在膽固醇生物合成的甲羥戊酸途徑中可以競爭性抑制HMG-CoA還原酶（膽固醇合成過程中的一種

4、關(guān)鍵酶），臨床上廣泛用于治療動脈粥樣硬化性疾病和高脂血癥。研究表明他汀類藥物具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，尤其可以抑制DCs的分化和成熟，我們的前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):阿托伐他汀可以抑制脾源性DCs的成熟，其表面協(xié)同刺激分子CD80和CD86表達(dá)明顯下降，而且經(jīng)他汀修飾的DCs可以減輕EAMG的癥狀和體內(nèi)炎癥，表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregcells)的上調(diào)，Th1/Th17型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)變。
　　他汀修飾的DCs對EAN或GBS

5、有無免疫調(diào)節(jié)作用，到目前為止還沒有相關(guān)報道。在本研究中，我們在體外通過阿托伐他汀修飾DCs使之具有誘導(dǎo)免疫耐受的功能，在發(fā)病的起始階段，利用上述DCs對EAN大鼠給予干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀修飾的DCs對EAN大鼠有保護(hù)作用，其機(jī)制主要與外周淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞數(shù)量和胸腺中Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)量的上調(diào)、外周淋巴結(jié)中NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞數(shù)目的上調(diào)、Th1/Th17型細(xì)胞因子的降低、外周神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤減少及淋巴細(xì)胞增殖的抑制等有關(guān)。<

6、br>　　研究目的:探討阿托伐他汀修飾的DCs對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎的治療作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.建立EAN模型并臨床評估
　　提取BPM，并完全溶于弗氏不完全佐劑(IFA)和H37Ra株結(jié)核分枝桿菌中以配制抗原，在大鼠雙后足墊皮下注射上述充分混勻的抗原，每只大鼠用量為200μl，以免疫動物造模。免疫當(dāng)天定為第0大，每天對大鼠的癥狀進(jìn)行觀察并臨床評估（雙盲法觀察）直至免疫后第14大。
　　

7、2.耐受性DCs的制備及鑒定
　　取健康Lewis大鼠的脾臟（注意無菌操作），通過研磨以制備單個核細(xì)胞懸液。破紅細(xì)胞膜后，在37℃、5％CO2條件下，將置于培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞液培養(yǎng)2h。棄懸浮細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基于上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)。18h后向培養(yǎng)瓶中加入溶于二甲基亞砜(DMSO)的阿托伐他?。ńK濃度10μM），對照培養(yǎng)瓶中加入等體積的DMSO。培養(yǎng)48h后收集懸浮的細(xì)胞分別標(biāo)記為他汀修飾的DCs（statin-DCs）

8、和未經(jīng)他汀修飾的DCs(untreated-DCs)。通過流式檢測不同組DCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子。
　　3.動物分組及干預(yù)
　　將EAN大鼠隨機(jī)分為三組，每組五只，在免疫第五天，治療組分別給予他汀修飾的DCs、未經(jīng)他汀修飾的DCs腹腔注射，每只大鼠注射的細(xì)胞數(shù)為1×106個，對照組（controlgroup）給予等體積的1640培養(yǎng)基腹腔注射。
　　4.制備淋巴結(jié)單個核細(xì)胞(MNC)
　　在E

9、AN發(fā)病高峰期處死大鼠，在無菌條件下取其腹股溝淋巴結(jié)，研磨淋巴結(jié)，制備MNC并計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個細(xì)胞/ml。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測淋巴結(jié)單個核細(xì)胞表面的CD80、CD86及MHC-Ⅱ取淋巴結(jié)MNC，洗滌后分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD86和MHC-Ⅱ抗體，以及PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD80抗體，經(jīng)孵育、重懸、過濾等步驟，流式細(xì)胞儀檢測。
　　6.流式檢測NK和NKT細(xì)胞
　　取淋巴結(jié)MNC，洗滌后

10、分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD3抗體和PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD161a抗體，經(jīng)孵育、重懸、過濾等步驟，流式細(xì)胞儀檢測。
　　7.流式檢測Th1/Th2/Th17型細(xì)胞因了
　　取淋巴結(jié)MNC，經(jīng)洗滌、固定、破膜等步驟，分別加入PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠IL-10抗體、FITC標(biāo)記的抗大鼠IFN-γ抗體、PE標(biāo)記的抗大鼠TNF-α抗體和FITC標(biāo)記的抗大鼠IL-17A抗體，經(jīng)孵育、重懸、過濾等步驟，流式細(xì)胞儀檢測。
　　

11、8.流式檢測Treg細(xì)胞
　　取淋巴結(jié)MNC，洗滌后分別加入PE標(biāo)記的抗CD25抗體（小鼠抗大鼠）和FITC標(biāo)記的抗CD4抗體（小鼠抗大鼠），4℃條件下孵育30min，避光，洗滌后加入固定/破膜工作液并混勻，4℃孵育過夜，避光。洗滌細(xì)胞后加入PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體4℃孵育30min，重懸、過濾后，流式細(xì)胞儀檢測。
　　9.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　將同組細(xì)胞懸液以同樣比例混合，加入0.5μlCFSE，37℃避光孵

12、育30min，加入預(yù)冷的1640，置于冰上孵育5min;離心棄上清后加入完全培養(yǎng)基，以相同細(xì)胞數(shù)種于24孔板，分別加入刺激物BPM或ConA，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72h;將24孔板中的細(xì)胞分別收集到流式管中，離心5min（1200rpm/min），棄上清后混勻;洗滌后加入PE標(biāo)記的抗大鼠CD4抗體，經(jīng)孵育、重懸、過濾等步驟，流式細(xì)胞儀檢測。
　　10.組織病理學(xué)檢測
　　在發(fā)病高峰期即免疫后第14天，處死大鼠后取

13、坐骨神經(jīng)，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、0.5％伊紅液染色、脫水、透明、封片等步驟，顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞的浸潤情況并計數(shù)。
　　11.胸腺免疫組化檢測
　　大鼠胸腺石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟、水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)，H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加稀釋好的一抗，大鼠抗小鼠/大鼠Foxp3，4℃過夜。復(fù)溫后洗滌，滴加HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗，37℃孵育1h，洗滌后DAB顯色，蘇

14、木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察大鼠胸腺中Foxp3+細(xì)胞的情況并計數(shù)。
　　研究結(jié)果:
　　1.阿托伐他汀對DC表型的影響
　　他汀修飾的DCs較未經(jīng)他汀修飾的DCs表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)明顯降低，而MHC-Ⅱ分子沒有顯著性差異。
　　2.三組大鼠的發(fā)病情況與臨床評分
　　與對照組相比，他汀修飾的DCs在免疫的第11到第14天，明顯緩解了EAN大鼠的臨床癥狀;而與未經(jīng)修飾的DCs相

15、比，他汀修飾的DCs在免疫的第12到第14天，明顯減輕了EAN大鼠的臨床癥狀;對照組與未經(jīng)他汀修飾的DCs治療組的臨床評分之間無明顯差異。
　　3.阿托伐他汀修飾的DCs治療減少EAN大鼠坐骨神經(jīng)中的炎性細(xì)胞
　　他汀修飾的DCs治療組中EAN大鼠坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞較未處理DCs治療組及對照組明顯減少。
　　4.阿托伐他汀修飾的DCs治療下調(diào)EAN大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)。
　　

16、與對照組相比，他汀修飾DCs治療組中EAN大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD80、CD86及MHC-Ⅱ均顯著降低;與未處理DCs治療組相比，上述指標(biāo)亦有降低，但是沒有顯著性差異。而且，淋巴結(jié)單個核細(xì)胞上CD80和CD86在對照組中和未處理DCs治療組中沒有顯著性差異，但是MHC-Ⅱ在未處理DCs治療組中明顯降低，與對照組相比。
　　5.他汀修飾的DCs治療降低了EAN大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中Th1和Th17型細(xì)胞因子的表達(dá)
　　與對照

17、組相比，他汀修飾DCs治療組中EAN大鼠淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中的IFN-γ，TNF-α和IL-17A均顯著降低;與未處理DCs治療組相比，IL-17A和TNF-α降低，但無顯著性差異;同時與對照組相比，未處理DCs治療組中IFN-γ和TNF-α顯著下降，而IL-17A在這兩組中無顯著性差異;三組之中，IL-10沒有顯著性差異。
　　6.他汀修飾的DCs上調(diào)了淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中NK和NKT細(xì)胞的數(shù)量
　　與對照組和未處理DCs治療

18、組相比，CD3-CD161a+NK細(xì)胞在他汀修飾DCs治療組明顯升高;與另外兩組相比，CD3+CD161a+NKT細(xì)胞在他汀修飾的DCs治療組也有升高，而且與對照組之間有顯著性差異，而與未處理DCs治療組無顯著性差異。
　　7.他汀修飾的DCs上調(diào)了淋巴結(jié)單個核細(xì)胞CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量
　　與對照組及未處理DCs治療組相比，他汀修飾的DCs上調(diào)了淋巴結(jié)單個核細(xì)胞中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量;而在

19、其他兩組之間未發(fā)現(xiàn)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量有顯著性差異。
　　8.他汀修飾DCs上調(diào)了胸腺中Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量
　　與對照組及未處理DCs治療組相比，他汀修飾DCs治療組中胸腺Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量明顯增加;另外兩組中Foxp3+細(xì)胞數(shù)量無顯著性差異。
　　9.他汀修飾的DCs治療抑制了淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)
　　與對照組及未處理DCs組相比，他汀修飾DCs顯著抑制了淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，無論是在BPM抗原

20、刺激的情況下，還是ConA抗原刺激的情況下;我們沒有發(fā)現(xiàn)在對照組和未處理DCs治療組之間，淋巴細(xì)胞增殖有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1.阿托伐他汀可誘導(dǎo)DCs成為耐受性DCs。
　　2.阿托伐他汀修飾的DCs干預(yù)，可以減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎的癥狀。
　　3.阿托伐他汀修飾的DCs在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎中可誘導(dǎo)中樞（胸腺）和外周（淋巴結(jié)）免疫耐受。
　　意義:
　　本研究通過阿托伐他汀誘導(dǎo)DCs