依維莫司對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　吉蘭巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)是一種影響周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)的自身免疫性疾病和急性炎癥性疾病，是目前世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的急性弛緩性癱瘓?jiān)蛑?是嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)突發(fā)事件的主要來(lái)源【1】。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)已經(jīng)作為GBS的經(jīng)典動(dòng)物模型被

2、廣泛接受。巨噬細(xì)胞在炎性環(huán)境中有兩種模式，即具有促炎作用的M1模式,和具有抗炎作用的M2模式，他們之間可以互相轉(zhuǎn)化【2-3】。依維莫司(RAD001)屬于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑，作為強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑，已被用于治療癌癥和自身免疫性疾病【4-10】并且發(fā)揮了積極的作用。
　　截至目前，許多抗炎、免疫調(diào)節(jié)劑及單克隆抗體均作為治療GBS的可能選擇而在EAN上試用，但有關(guān)RAD001對(duì)于GBS的調(diào)節(jié)及治療作用尚無(wú)報(bào)道。基

3、于以往關(guān)于RAD001免疫調(diào)節(jié)作用的研究，我們假設(shè)RAD001對(duì)于EAN具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，分別在EAN大鼠的免疫階段和發(fā)病階段應(yīng)用RAD001進(jìn)行藥物干預(yù)，通過(guò)觀察EAN大鼠的臨床評(píng)分、病理變化、電生理指標(biāo)、M1/M2巨噬細(xì)胞表型的分布和炎性環(huán)境變化，來(lái)分析mTOR通路的抑制和Akt的激活對(duì)EAN的作用，進(jìn)而評(píng)價(jià)RAD001對(duì)EAN大鼠的治療作用，并探討其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　乳化P0180-199肽段后，誘

4、導(dǎo)Lewis大鼠成模。將造模后的大鼠隨機(jī)分組，分為對(duì)照組，RAD001預(yù)防用藥組和治療用藥組。采用雙盲法觀察并評(píng)估大鼠每天的臨床癥狀。在疾病高峰期，即免疫后第16天，進(jìn)行坐骨神經(jīng)肌電圖檢測(cè)評(píng)估坐骨神經(jīng)電生理受損情況，指標(biāo)包括誘發(fā)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅、潛伏期和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。在疾病高峰

5、期，對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行取材，準(zhǔn)備進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘情況，并進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)分析巨噬細(xì)胞分化情況；同時(shí)提取坐骨神經(jīng)總蛋白，進(jìn)行蛋白印跡分析，探討mTOR通路蛋白變化情況。在疾病高峰期，對(duì)大鼠脾臟取材，提取單個(gè)核細(xì)胞，分析淋巴細(xì)胞增殖情況，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子表達(dá)情況及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞分化情況。應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05為差異有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，兩個(gè)RAD001治療組均可改善EAN大鼠高峰期的臨床癥狀，預(yù)防組可延遲EAN大鼠的發(fā)病時(shí)間。RAD001治療可以減輕EAN引起的周?chē)窠?jīng)損傷。與對(duì)照組相比，RAD001預(yù)防組和治療組炎性細(xì)胞數(shù)量減少,髓鞘脫失程度減輕（p<0.05）。神經(jīng)電生理檢測(cè)表明，控制組MNCV明顯減慢，兩個(gè)治療組CMAP明顯升高，潛伏期顯著縮短。
　　2. Western印跡分析RAD001對(duì)

7、于EAN大鼠坐骨神經(jīng)中p-P70S6K、p-4E-BP1和p-Akt的作用，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，RAD001預(yù)防組和治療組中EAN大鼠坐骨神經(jīng)切片中p-Akt表達(dá)增加，p-4E-BP1和p-P70S6K表達(dá)減少(p<0.05)。
　　3. P0180-199刺激后，相對(duì)于對(duì)照組的OD值（2.35±0.34），在預(yù)防組（0.98±0.16）,和治療組（0.73±0.18）的淋巴細(xì)胞增殖均可被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。對(duì)

8、于沒(méi)有P0180-199的刺激，三個(gè)組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。說(shuō)明RAD001抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
　　4.坐骨神經(jīng)免疫熒光結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，RAD001預(yù)防組和治療組均顯示M2巨噬細(xì)胞表型表達(dá)升高，M1巨噬細(xì)胞表型表達(dá)降低(p<0.05)。脾單個(gè)核細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析表明，RAD001預(yù)防組和治療組M2巨噬細(xì)胞水平較對(duì)照組有明顯升高（p<0.05）。說(shuō)明RAD001促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化。
　　5. RAD

9、001對(duì)細(xì)胞因子的影響:與對(duì)照組相比，一些促炎癥因子（IL-1α、IFN-γ、RANTES和IL-17）在蛋白和/或mRNA水平上在RAD001預(yù)防組和治療組表達(dá)量明顯降低,而抗炎細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β和IL-4）在蛋白和/或mRNA水平上含量顯著增加(p<0.05)。但三組中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL–12、IL-13、TNF-α或GM-CSF沒(méi)有顯著區(qū)別。
　　研究結(jié)論：
　　我們的研究表明