L161982對大鼠實驗性自身免疫性神經炎中巨噬細胞亞型變化的影響.pdf

1、研究目的:
　　吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)是以周圍神經組織脫髓鞘病變及炎性細胞浸潤為病理特點的自身免疫性周圍神經性疾病，臨床表現(xiàn)為急性對稱性弛緩性肢體癱瘓。實驗性自身免疫性神經炎(experimental allergicneuritis，EAN)是T細胞介導的周圍神經系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病，因其與GBS具有相似的臨床及病理特點而成為研究人類GBS的經典動物模型。
　　在EAN的

2、發(fā)病過程中，巨噬細胞作為一種經典的免疫細胞，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明，巨噬細胞在EAN病理過程中主要表現(xiàn)為兩種亞型:經典活化的M1亞型巨噬細胞及選擇性活化的M2亞型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有促進炎癥進展及較強的吞噬作用，而M2型巨噬細胞具有抑制炎癥，促進組織重塑和修復作用。巨噬細胞由M1型向M2型轉化的機制仍未十分明確。
　　前列腺素(PG)作為疾病炎癥過程中的非細胞介質參與EAN炎癥的發(fā)生發(fā)展。尤其以前列腺素E2與

3、前列腺素EP2及EP4受體相互作用的促炎性作用更為突出。已有研究證實，使用PGE2-EP4受體拮抗劑L161982可以促進包括EAE在內的自身免疫疾病的炎癥恢復，減輕臨床癥狀。
　　本研究通過建立EAN大鼠模型，使用前列腺素E2-EP4受體拮抗劑L161982對EAN不同發(fā)病階段進行干預，觀察巨噬細胞M1及M2亞型在EAN不同發(fā)病階段的比例變化及其相關細胞因子的表達變化，探討PGE2-EP4信號通路對M1與M2亞型轉化的影響，進一

4、步探索促進EAN自發(fā)性恢復的機制。
　　2.研究方法:
　　1.抗原制備采用高速離心法自新鮮的牛神經根提取周圍神經髓磷脂(bovine peripheralnerve myelin，BPM)。將提取的BPM溶于含H37Ra熱滅活結核菌的不完全弗氏佐劑中，邊震蕩混勻邊加入等量生理鹽水制成混懸液。其中，每100ul抗原乳劑含BPM5mg，結核桿菌1mg。
　　2.實驗動物處理
　　2.1 建立EAN模型21只健康、清

5、潔的6-8周(160-170g)齡雌性Lewis大鼠于SPF級實驗室中適應性飼養(yǎng)1周。10％水合氯醛(0.3g/kg)麻醉大鼠，于大鼠雙后足墊皮下注射制備好的抗原乳劑（每只200ul），制備EAN動物模型。
　　2.2 實驗動物分組及藥物干預將21只EAN大鼠隨機分為A、B、C三組，其中將A組設為空白對照組。A組大鼠每日腹腔注射L161982溶媒(5mg/kg)，B組大鼠自免疫前1天～免疫第8天（免疫階段）每日腹腔注射L16198

6、2(5mg/kg)、C組大鼠自免疫第5～16天（發(fā)病期）每日腹腔注射L161982(5mg/kg)。
　　3.臨床評分自免疫前1天開始每日對3組大鼠進行體重稱量和臨床評分，直至免疫第16天。臨床評分標準如下:①0分:正常;②0.5分:全尾肌張力下降;③1.0分:尾部肌肉癱，松軟拖地;④1.5分:輕度后肢無力或肌張力降低;⑤2.0分:重度后肢無力或輕度后肢癱;⑥2.5分:中度后肢癱;⑦3.0分:嚴重后肢癱;⑧4.0分:嚴重四肢癱。<

7、br>　　4.大鼠腹腔巨噬細胞提取于免疫第16天（發(fā)病高峰期）處死3組大鼠，于無菌實驗臺上，向大鼠腹腔注射10mlDMEM，靜置5min后，打開大鼠腹腔，待腸管變扁時，用2ml無菌一次性吸管吸取腹腔灌洗液，置于離心管中。于離心機上離心后，去上清，留沉淀，制備單細胞懸液。對細胞進行計數，按照將細胞按2×106個/mL的密度接種于6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后換液，去掉未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至第3天。
　　5.

8、流式細胞術檢測EAN大鼠腹腔巨噬細胞亞型比例3組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)3天后，取6支流式管(編號為1、2、3、4、5、6)，試管1～5每管中加入106個/mL巨噬細胞。試管6為空白對照。用PE標記的CD86抗體、Alexa Flour647標記的CD163抗體及抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗等不同熒光抗體組合分別標記M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞及總巨噬細胞。試管1加入PE標記的CD86抗體，試管2加入Alexa Flour647

9、標記的CD163抗體，試管3加入抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗，試管4加入PE標記的CD86抗體、抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗，試管5加入Alexa Flour647標記的CD163抗體、抗兔CD68抗體及FITC標記熒光二抗。試管6為空白對照。充分混勻后，置于室溫暗處孵育30min后，各管加入2mLBSA進行洗滌，1500r/min離心5min后，棄上清。每管加入400μ LPBS重懸，經細胞篩網過濾后，加入1％的多

10、聚甲醛100μ L固定，待上機檢測。用流式細胞術檢測3組大鼠兩種巨噬細胞亞群比例。
　　6.ELISA檢測EAN大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清細胞因子3組EAN大鼠脫頸處死后，無菌條件下摘取EAN大鼠脾臟，置于含5mlDMEM培養(yǎng)基的離心管中，將脾臟置于無菌實驗臺上剪碎后于細胞篩上研磨脾臟碎片，收集脾單個核細胞研磨液。置于離心管中，1200 rpm/min，離心5 min后棄上清并混勻。每管加入2ml紅細胞裂解液，于室溫下靜置5min后

11、，待細胞懸液變?yōu)闊o色后，每管加入1ml胎牛血清終止破紅。1200 rpm/min，離心5 min后棄上清，加入2mlDMEM培養(yǎng)基并混勻。充分混勻后用細胞計數板對細胞進行計數。將細胞按2×106個/mL的密度接種于6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3天后，收集六孔板中細胞培養(yǎng)上清，置于2ml離心管中，3組大鼠單個核細胞培養(yǎng)3天后，取各組大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測3組大鼠脾單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-12及

12、IL-10的含量。
　　7.統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件，應用單因素方差分析(one—factor analysis ofvariance，ANOVA)比較3組間差異，兩兩比較采用LSD法，結果以均值±標準差(standard deviatio，SD)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.各組大鼠的發(fā)病情況和臨床評分自免疫后第6天至第15天，各組大鼠均發(fā)生EAN癥狀。與A組比較，B組、C組發(fā)

13、病時間均明顯延遲(P＜0.05)，B組大鼠發(fā)病時間較C組明顯延遲(P＜0.05);與A組比較，B組、C組發(fā)病高峰期臨床評分明顯降低(P＜0.05);與C組比較，B組大鼠臨床評分降低明顯(P＜0.05)。
　　2.流式細胞術檢測3組大鼠巨噬細胞亞群比例A組相比，使用L161982治療的B組、C組中，CD86+細胞占腹腔灌洗細胞的百分比明顯降低(P＜0.05)，CD86+細胞占CD68+細胞的百分比明顯降低，CD163+細胞占CD68

14、+細胞的百分比明顯升高(P＜0.05);與C組比較，B組中CD86+細胞占腹腔灌洗細胞的百分比降低更明顯(P＜0.05)，CD86+細胞占CD68+細胞的百分比降低更明顯(P＜0.05)，CD163+細胞占CD68+細胞的百分比升高更明顯(P＜0.05)。
　　3.ELISA法檢測3組大鼠脾單核細胞培養(yǎng)上清IL-12、IL-10的含量與A組相比，使用L161982治療的B組、C組中，脾單核細胞培養(yǎng)上清中IL-12表達量明顯降低(P

15、＜0.05)，與C組相比，B組中IL-12的含量降低更明顯(P＜0.05);與A組相比，B組、C組中IL-10的表達量明顯升高(P＜0.05)，與C組相比，B組中IL-10的表達量升高更明顯(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.L161982降低了EAN大鼠中M1型巨噬細胞占總巨噬細胞的比例，升高了M2型巨噬細胞占總巨噬細胞的比例，免疫階段作用更明顯。
　　2.L161982抑制了M1型巨噬細胞相關細胞因子IL-12