脫氫表雄酮對實驗性自身免疫性神經炎保護作用的研究.pdf

1、研究目的: 格林-巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是引起遲緩性麻痹的主要疾病，是外周神經的炎癥性脫髓鞘疾病。實驗性自身免疫性神經炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是CD4+T細胞介導的外周神經自身免疫性脫髓鞘疾病，其臨床經過、神經電生理檢查及病理學改變與GBS最常見的臨床亞型一急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)神經炎（acute inflammation dem

2、yelinative polyradiculoneuropathy，AIDP）極為相似，是公認的研究GBS的經典動物模型。目前，GBS的治療主要是血漿置換或靜脈注射丙種球蛋白，雖然其能縮短病程，加快病情恢復，但仍有大約5％病死率，20％的患者遺留永久性殘疾。多數學者認為，糖皮質激素等免疫抑制劑的對本病無效。因此，有必要探討治療GBS的新方法。 脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一種19碳類固醇

3、，是雌激素和雄激素的前體物質，也是目前尚不明確的多種免疫調節(jié)性類固醇的前體物質。體內、外研究證實DHEA及其代謝產物具有抗炎、抗增殖和免疫調節(jié)活性，對人和動物的免疫系統(tǒng)可產生有益的作用。EAN是Th1細胞介導的外周神經自身免疫性脫髓鞘疾病，神經內膜下T淋巴細胞、巨噬細胞浸潤及多灶性、節(jié)段性髓鞘脫失為主要病理改變，促炎性細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-12、NO等）在其發(fā)病機制中起關鍵作用。目前國內外尚未見有應用DHEA治療EA

4、N的報道，基于以往體內外研究證實的DHEA對免疫系統(tǒng)的作用，我們應用DHEA治療發(fā)病初期EAN，通過觀察EAN的臨床、病理及免疫指標，評價DHEA對發(fā)病初期EAN的治療作用并探討其免疫保護機制。 方法: 1.抗原：采用超速離心法自牛脊神經根提取周圍神經髓磷脂（bovine peripheral nerve myelin， BPM）。 2.實驗動物：6-8周齡雌性Lewis大鼠36只，體重150-170g，SPF級

5、飼養(yǎng)。 3.EAN模型的建立及臨床評分：大鼠經適應性飼養(yǎng)一周，氯胺酮（10mg/Kg）麻醉。將100μl抗原乳劑（含BPM5mg、結核桿菌1mg、不完全弗氏佐劑50μl、生理鹽水50μl）注入雙側后肢足墊皮下。于免疫前即時及免疫后每日進行臨床評估，直至免疫后28天。臨床評分：0：正常；0.5：全尾肌張力下降；1.0：尾部肌肉癱，松軟拖地；1.5：輕微后肢無力，肌張力下降；2.0：明顯后肢無力或輕度后肢癱；2.5：中度后肢癱；3.

6、0：嚴重后肢癱；4：嚴重四肢癱。 4.脫氫表雄酮（DHEA）治療：將大鼠隨機分為DHEA0.5mg/劑治療組、2mg/劑治療組和對照組，每組各12只。治療組于免疫后第5天開始皮下注射DHEA，體積50μl，每日一次，至免疫后28天。對照組皮下注射相同體積的DHEA溶媒二甲基亞砜（DMSO）。 5.組織病理學檢查：于免疫后16天處死大鼠，每組各7只，取坐骨神經近脊髓段，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，縱行切片（5-6μm，每

7、根神經2張連續(xù)切片），HE染色，應用計算機圖像分析系統(tǒng)40倍物鏡下采集圖像，每張切片隨機取5個視野，計數坐骨神經中浸潤的單個核細胞，取其平均值，結果以細胞數/m㎡組織表示。 6.免疫組化檢測：大鼠坐骨神經石蠟切片，常規(guī)脫蠟致水，經阻斷內源性過氧化物酶活性、抗原修復、牛血清白蛋白封閉處理，分別滴加一抗（山羊抗大鼠IFN-γ、TNF-α多克隆抗體）和二抗（辣根過氧化酶標記兔抗山羊IgG），DAB顯色，蘇木蘇復染，脫水，透明，封固。4

8、0倍物鏡下采集圖像，觀察大鼠坐骨神經中細胞陽性反應，結果以細胞數/m㎡組織表示。 7.單個核細胞體外增殖試驗：取免疫后16天EAN大鼠腹股溝淋巴結和脾臟制備單個細胞懸液（2×106/ml），懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基，接種到96孔培養(yǎng)板，分別加入10μl BPM、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）和磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）培養(yǎng)48小時，再加入3H-

9、甲基胸腺嘧啶脫氧核苷1μCi/孔，18小時后收集細胞，β-液體閃爍儀檢測測定胸腺嘧啶核苷結合量，結果以每分鐘放射性熒光閃爍計數值（cpm）表示。 8.單個核細胞培養(yǎng)上清液細胞因子檢測：來自引流淋巴結和脾臟的單個核細胞懸液（2×106/ml），加入BPM（終濃度20μg/ml），培養(yǎng)48小時，收獲上清液。應用酶聯免疫分析試劑盒檢測TNF-α、IFN-γ、IL-10，操作按說明書步驟進行。標準品和樣本均設雙復孔，結果以pg/ml表示

10、。 9.統(tǒng)計學方法：應用SPSS13.0軟件對資料進行統(tǒng)計分析，數據以x±s表示。應用單因素方差分析或秩和檢驗（Kruskal-Wallis檢驗法）進行組間比較，組間差異有統(tǒng)計學意義則用SNK法或Bonferroni法進行組間兩兩比較，P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.DHEA延遲EAN發(fā)病時間：三組大鼠在發(fā)病時間上表現出明顯差異，DHEA2mg治療組發(fā)病時間為11.83±0.94天，0.5mg治療組

11、為10.92±1.08天，對照組為9.17±0.94天。與對照組比較，兩種劑量DHEA治療組發(fā)病時間均延遲（P<0.05，P<0.05），DHEA2mg治療組與0.5mg治療組比較發(fā)病時間亦明顯延遲（P<0.05）。 2.DHEA降低EAN高峰期臨床評分：疾病高峰期（免疫后第16d）臨床評分顯示DHEA2mg治療組為1.42±0.73，0.5mg治療組為2.00±0.56，對照組為2.29±0.62。與對照組比較，DHEA2mg

12、治療組疾病高峰期臨床評分明顯降低（P<0.05）。DHEA2mg治療組疾病高峰期臨床評分明顯低于0.5mg治療組（P<0.05）。0.5mg治療組疾病高峰期評分低于對照組，但經統(tǒng)計學處理無顯著差異。 3.DHEA減少炎性細胞在外周神經浸潤：疾病高峰期大鼠坐骨神經組織病理學檢查結果顯示， DHEA2mg治療組骨神經中炎性細胞浸潤數目為37.00±29.59個/m㎡組織，0.5mg治療組為62.00±37.11/m㎡組織，對照組為1

13、05.50±31.05/m㎡組織。與對照組比較，DHEA2mg治療組和0.5mg治療組坐骨神經中炎性細胞浸潤數目均明顯減少（P<0.05，P<0.05）。DHEA2mg治療組炎性細胞浸潤數目較0.5mg治療組減少，但經統(tǒng)計學處理無意義。 4.DHEA抑制脾臟單個核細胞增殖反應：于EAN高峰期高峰期檢測大鼠引流淋巴結和脾臟單個核細胞體外增殖， BPM、PHA誘導的和無抗原刺激（PBS）組單個核細胞增殖（cpm）分別為：DHEA2m

14、g治療組2900±672、4500±1581和594±220；0.5mg治療組5125±1433、6562±1720和1150±160；對照組9125±1941、11680±2344和1338±358。結果顯示，與對照組比較兩種劑量DHEA治療組均能明顯抑制BPM和PHA誘導的單個核細胞增殖（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）；與對照組比較，DHEA2mg治療組對無抗原刺激組（PBS）單個核細胞增殖有明顯抑制作用（

15、P<0.05），0.5mg治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。 5.DHEA減少外周神經促炎細胞因子產生：應用免疫組化技術檢測疾病高峰期大鼠坐骨神經中IFN-γ、TNF-α表達，結果顯示IFN-γ、TNF-α陽性反應細胞數分別為：DHEA2mg治療組17.50±13.03個/m㎡組織、13.63±10.03個/m㎡組織，0.5mg治療組25.75±13.78個/m㎡組織、20.50±11.41個/m㎡組織，對照組64.88±23

16、.22個/m㎡組織、47.00±16.63個/m㎡組織。 6.DHEA影響單個核細胞培養(yǎng)上清液細胞因子水平：應用酶聯免疫吸附法檢測引流淋巴結和脾臟單個核細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平。 結論: 1.應用兩種劑量脫氫表雄酮（DHEA）治療發(fā)病初期EAN，與對照組比較，可明顯延緩發(fā)病時間，降低疾病高峰期臨床評分，減少坐骨神經中炎性細胞浸潤數目，提示DHEA對外周神經自身免疫性疾病有治療作用。

17、 2.應用兩種劑量DHEA治療發(fā)病初期EAN，與對照組比較，可明顯抑制BPM誘導的單個核細胞增殖，減少坐骨神經中IFN-γ、TNF-α陽性反應細胞數目，降低BPM刺激的單個核細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α水平。提示DHEA可抑制EAN大鼠自身反應性T淋巴細胞增殖和促炎性細胞因子過度表達，抑制細胞免疫反應。 3.DHEA可降低全身和病灶局部IFN-γ、TNF-α水平，對IL-10產生無影響。表明DHEA對EAN的治療作用