苦參素對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、目的：
　　以Wistar雌性大鼠誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis,EAE）模型作為多發(fā)性硬化（MultipleSclerosis，MS）的動(dòng)物模型，觀察苦參素（Matrine，MAT）對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠（EAE）臨床癥狀及組織病理學(xué)的影響，檢測(cè)分析大鼠發(fā)病過(guò)程中相關(guān)趨化因子及其受體、ProNGF/NGF及其受體的表達(dá)變化，并探討其對(duì)EAE的

2、防治作用及可能的免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，旨在為多發(fā)性硬化癥（MS）提供更有效的預(yù)防治療途徑及可靠的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、建立EAE模型：將剛制備的新鮮豚鼠全脊髓勻漿（GuineaPigSpinalCordHomogenate，GPSCH）與含卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG）的等體積完全福氏佐劑（CompleteFreundAdjuvant，CFA）混合，制備成穩(wěn)定的抗原乳劑

3、作為免疫抗原，免疫Wistar雌性大鼠誘導(dǎo)建立EAE模型，正常對(duì)照組給予相同劑量的完全福氏佐劑。免疫后每天觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的活動(dòng)情況，定時(shí)測(cè)量大鼠體重，并記錄其神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體重變化、癥狀表現(xiàn)及其中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變的觀察和檢測(cè)，評(píng)估EAE模型。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法：取40只SPF級(jí)Wistar雌性大鼠，6～8周齡大小，體重在180～200g，將其隨機(jī)分配為四組：正常對(duì)照組（Normal）、EAE模型組（Sal

4、ine）、MAT高劑量組（MAT-H）、MAT低劑量組（MAT-L），每組10只。自免疫當(dāng)天起，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的干預(yù)措施，正常對(duì)照組、EAE模型組每日給與6.70ml/kg生理鹽水注射液腹腔注射；MAT-H組每日腹腔注射6.70ml/kg(250mg/kg)苦參素注射液；MAT-L組每日腹腔注射6.70ml/kg(150mg/kg)苦參素注射液，持續(xù)給藥16天至處死。
　　3、動(dòng)物樣本采集：在免疫后第17天，將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后采取

5、其眼眶靜脈血，分離血清備用；并在充分灌注后留取實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織和脊髓組織，部分于4％多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）中固定，石蠟包埋、切片，其余立即投入液氮中，后在-80oC條件下保存?zhèn)溆谩?br>　　4、指標(biāo)檢測(cè)：應(yīng)用蘇木素-伊紅（HematoxylinandEosinStaining，HE）和變色酸-2R-亮綠（Chromotrope2R-BrilliantGreen，C-2R-BG）染色觀察實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓炎性浸潤(rùn)及

6、脫髓鞘情況；通過(guò)免疫熒光雙染法（ImmunofluorescentDoubleStaining）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocytes，OLGs）的凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linkedImmunoabsorbentassay，ELISA）測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠血清中γ干擾素誘導(dǎo)蛋白（CXCchemokineligend-10，CXCL10）的表達(dá)；使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（ReverseTranscrip

7、tion-polymeraseChainReaction，RT-PCR）分析單核細(xì)胞趨化蛋白-1（CCchemokineligand-2，CCL2）及CC趨化因子受體-2（CCchemokineligandreceptor-2，CCR2）mRNA轉(zhuǎn)錄水平；免疫組織化學(xué)法（ImmunohistochemicalMethod）檢測(cè)脊髓中神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體（Pro-nerveGrowthFactor，pro-NGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NerveG

8、rowthFactor，NGF）、p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體（p75Neurotrophinreceptor，p75NTR）、酪氨酸激酶受體A（TyrosinekinasereceptorA，TrkA）的表達(dá)。使用spss17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠臨床評(píng)估：①發(fā)病率：正常對(duì)照組大鼠未發(fā)病；EAE模型組大鼠全部發(fā)病，其發(fā)病率顯著高于正常對(duì)照組(p<0.05)；MAT高低劑量組分別有8、7只大鼠發(fā)病

9、。MAT-H組和MAT-L組大鼠發(fā)病率均低于EAE模型組(但p>0.05)，但MAT-H組和MAT-L組組間大鼠發(fā)病率無(wú)顯著性差異(p>0.05)。②體重變化：自免疫后第二天，正常對(duì)照組大鼠體重持續(xù)增加，苦參素高低劑量組和EAE模型組大鼠體重均呈現(xiàn)先上升后下降的總體趨勢(shì)。免疫后第17天，EAE模型組大鼠體重顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01)，MAT-H組、MAT-L組大鼠的平均體重均明顯高于EAE模型組(p<0.01)，且MAT-H、M

10、AT-L組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。③神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分：EAE模型組大鼠免疫后第10天EAE癥狀開(kāi)始顯現(xiàn)，后逐漸加重，苦參素高低劑量組大鼠發(fā)病時(shí)間和病情高峰期均較EAE模型組后移，癥狀也相對(duì)減輕。免疫后第17天，EAE模型組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著高于苦參素高低劑量組(p<0.01，p<0.01)；且苦參素高低劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　2、組織病理學(xué)變化：①HE：EAE模型組大鼠脊髓內(nèi)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞

11、及單核細(xì)胞聚集于血管周?chē)市涮讟痈淖?，且平均炎癥浸潤(rùn)評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01)；MAT高低劑量組脊髓組織平均炎癥浸潤(rùn)評(píng)分顯著低于EAE模型組(p<0.01，p<0.01)。②C-2R-B：正常對(duì)照組大鼠脊髓內(nèi)無(wú)髓鞘脫失顯現(xiàn)，苦參素高低劑量組、EAE模型組大鼠脊髓內(nèi)均顯現(xiàn)髓鞘脫失情況；且與EAE模型組相比，苦參素高低劑量組大鼠脊髓髓鞘脫失評(píng)分明顯降低(p<0.01，p<0.01)；且苦參素高低劑量組間有顯著性差異(p<0.01

12、)。
　　3、各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓CXCR3及血清CXCL10表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，EAE模型組及苦參素高低劑量組大鼠脊髓CXCR3及血清CXCL10表達(dá)水平均顯著升高(p<0.01)；與EAE模型組相比，苦參素高低劑量組大鼠脊髓CXCR3及血清CXCL10的表達(dá)水平均有所降低(p<0.01)，且MAT治療組大鼠脊髓CXCR3及血清CXCL10水平隨MAT治療劑量增加而明顯降低；苦參素高低劑量組大鼠脊髓CXCR3及血清CXCL10的

13、表達(dá)水平均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。
　　4、各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓CCL2、CCR2mRNA轉(zhuǎn)錄水平：與正常對(duì)照組相比，EAE模型組、苦參素高低劑量組大鼠脊髓中CCL2、CCR2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(p<0.01)；苦參素高低劑量組大鼠脊髓中CCL2、CCR2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于EAE模型組(p<0.01)；且苦參素高低劑量組大鼠脊髓CCL2、CCR2mRNA轉(zhuǎn)錄水平均有顯著性差異(p<0.01)。
　　5、

14、少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡情況：EAE模型組及MAT高低劑量組大鼠脊髓組織少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01)，苦參素高低劑量組少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡顯著低于EAE模型組，且苦參素高低劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　6、各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓NGF、TrkA的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，EAE模型組大鼠脊髓NGF、TrkA表達(dá)水平均顯著降低(p<0.01)；與EAE模型組相比，苦參素高低劑量組大鼠脊髓NGF、TrkA表達(dá)水

15、平均升高(p<0.01)；苦參素高低劑量組大鼠脊髓組織NGF、TrkA表達(dá)水平隨苦參素治療劑量增加而明顯升高，且其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　7、各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓pro-NGF、P75NTR的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，EAE模型組、苦參素高低劑量組大鼠脊髓pro-NGF、P75NTR表達(dá)水平均明顯升高(p<0.01)；與EAE模型組相比，苦參素高低劑量組大鼠脊髓pro-NGF、P75NTR表達(dá)水平均降低(p<0.01

16、)；且苦參素高低劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　8、相關(guān)性分析：各實(shí)驗(yàn)組大鼠CCL2與其受體CCR2mRNA轉(zhuǎn)錄水平、CXCL10與其受體CXCR3表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(p<0.05)；且各實(shí)驗(yàn)組大鼠CCL2mRNA轉(zhuǎn)錄水平及CXCL10表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度即大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分均呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　苦參素（MAT）對(duì)Wistar雌性大鼠誘發(fā)的EAE模型具有防治作用，可降低實(shí)驗(yàn)