苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的防治作用及免疫機制的探討.pdf

1、目的:
　　 通過實驗研究觀察實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)Wistar大鼠應(yīng)用苦參素(matrine，MAT)進行疾病預(yù)防和治療過程中的相關(guān)臨床癥狀、動物脊髓組織病理學改變以及發(fā)病過程中關(guān)鍵的體系及發(fā)揮重要作用的相關(guān)的細胞因子如黏附分子(adhesionmolecules)ICAM-1(intercellularadhesionmolecule

2、-1),VCAM-1(vascularcelladhesionmolecule-1)，趨化因子(chemokines)CCL3(MIP(l)a3)，CCL5(RANTES)，氧化應(yīng)激系統(tǒng)（systemofoxidativestress）相關(guān)因子Nrf2(NF-E2-relatedfactor2)，HO-1(hemeoxygenase-1)，Toll樣受體-4(Toll-likereceptor4，TLR4)和血清中髓樣分化蛋白-2(my

3、eloiddifferentiationfactor-2，MD-2)，白介素-4(interleukin-4，IL-4)，白介素-5（interleukin-5，IL-5），白介素-10（interleukin-10，IL-10），轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-beta1，TGF-β1），初步探討苦參素對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomye

4、litis，EAE)Wistar大鼠的預(yù)防作用和治療作用及其可能的免疫機制，為探討多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis，MS)疾病發(fā)生的過程和原理以及新的預(yù)防方法和有效治病手段和途徑提供確切可靠的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、動物分組:按照隨機分配的原則將50只體重180～220g之間的清潔級雌性Wistar大鼠分為5組——EAE模型組(Model)、正常對照組（Normal）、MAT低劑量組(MAT-

5、L)、MAT中劑量組(MAT-M)、MAT高劑量組(MAT-H)。
　　 2、動物模型誘導:將豚鼠的脊髓制成全脊髓勻漿(guineapigspinalcordhomogenate，GPSCH)，并與含有6mg/ml卡介苗的完全弗氏佐劑(completefreundadjuvant，CFA)相混合，制成誘導模型的抗原乳劑，并免疫Wistar大鼠誘導實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型。自免疫當天起密切觀察并記錄各組大鼠的活動情況，進食及飲

6、水情況，并測量記錄各組大鼠的體重變化、臨床表現(xiàn)癥狀以及神經(jīng)功能學評分。
　　 3、各組大鼠給藥方式:正常對照組和模型組大鼠自免疫當日起至處死當天，每日一次經(jīng)腹腔注射6.7mg/kg生理鹽水注射液;MAT高劑量組自免疫當日起至處死當天，每日一次腹腔注射6.7mg/kg(250mg/kg)苦參素注射液;MAT中劑量組自免疫當日起至處死當天，每日一次腹腔注射6.7mg/kg(200mg/kg)苦參素注射液;MAT低劑量組自免疫當日起至

7、處死當天，每日一次腹腔注射6.7mg/kg(150mg/kg)苦參素注射液。
　　 4、實驗樣本采集:實驗大鼠于免疫后第17天，腹腔注射10％水合氯醛至麻醉，進行眼眶后靜脈叢采血，取血清保存?zhèn)溆?取大鼠脊髓腰膨大處固定于4％多聚甲醛中，石蠟包埋制備成5μm的切片，保存?zhèn)溆?剩余脊髓剪成約100mg的小塊，置于凍存管中，立即投入液氮中保存標本以備用。
　　 5、指標檢測:蘇木素-伊紅(HE)和變色酸-2R-亮綠(C-2R-

8、BG)染色觀察脊髓組織病理學改變，免疫組化法檢測大鼠脊髓組織中黏附分子和氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)因子的表達，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測趨化因子，MD-2，IL-4，IL-5，IL-10及TGF-β1在血清中的表達，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測脊髓組織中TLR4的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、發(fā)病率:正常對照組動物未出現(xiàn)發(fā)病癥狀;模型組動物的發(fā)病率明顯高于MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組(p＜0.05

9、);MAT-H組及MAT-M組動物發(fā)病率低于MAT-L組發(fā)病率，但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　 2、體重和神經(jīng)功能學評分:免疫后至處死當日模型組及三個MAT治療干預(yù)組大鼠的體重變化呈下降趨勢，正常對照組大鼠的體重持續(xù)上升;模型組與三個MAT治療組相比，大鼠的體重變化較大(p＜0.05);三個MAT治療組間大鼠的體重變化有差異，且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。模型組大鼠的平均神經(jīng)功能評分明顯高于MAT治療組(p＜0.0

10、5);三個MAT治療組間大鼠的神經(jīng)功能學評分均存在差異，且差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 3、組織病理學改變:正常對照組大鼠脊髓內(nèi)未顯現(xiàn)出炎性細胞浸潤與髓鞘脫失的情況，模型組與MAT治療組大鼠的脊髓組織內(nèi)均出現(xiàn)炎性細胞浸潤以及髓鞘脫失的情況;模型組動物脊髓炎性細胞浸潤與髓鞘脫失較MAT治療組嚴重(p＜0.05);MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組間炎癥浸潤細胞及髓鞘脫失情況均存在明顯差異，差異有統(tǒng)計學意義(p＜

11、0.05)。
　　 4、脊髓中黏附分子ICAM-1，VCAM-1表達的變化:模型組及MAT治療組大鼠脊髓中黏附分子ICAM-1，VCAM-1表達水平與正常對照組相比，均有所升高(P＜0.05);與模型組相比，MAT治療組大鼠脊髓中黏附分子ICAM-1，VCAM-1表達水平均有所降低，且差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組間大鼠脊髓中黏附分子ICAM-1，VCAM-1的表達均存在統(tǒng)計學差異(

12、p＜0.05)。
　　 5、血清中趨化因子CCL3、CCL5的表達變化:與正常組比較，模型組及MAT治療組大鼠血清中趨化因子CCL3、CCL5的表達水平均升高(p＜0.05);與模型組相比，MAT治療組大鼠血清中趨化因子CCL3、CCL5的表達水平均有所降低(p＜0.05)，MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組間大鼠血清中趨化因子CCL3、CCL5的表達水平均存在統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　 6、脊髓中氧化應(yīng)激

13、系統(tǒng)相關(guān)因子Nrf2，HO-1表達的變化:模型組及MAT治療組大鼠脊髓中氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)因子Nrf2，HO-1的表達水平與正常對照組相比，均有所升高(p＜0.05);與模型組相比，MAT治療組大鼠脊髓中氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)因子Nrf2，HO-1的表達水平均有所升高，且差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組間大鼠脊髓中氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)因子Nrf2，HO-1的表達水平均存在統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。

14、>　　 7、脊髓中TLR4及血清中MD-2表達的變化:與正常組比較，模型組及MAT治療組大鼠脊髓中TLR4及血清中MD-2的表達水平均升高(p＜0.05);與模型組相比，MAT治療組大鼠脊髓中TLR4及血清中MD-2的表達水平均有所降低(p＜0.05)，MAT-H組、MAT-M組、MAT-L組間大鼠脊髓中TLR4及血清中MD-2的表達水平均存在統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　 8、血清中IL-4、IL-5，IL-10及TGF

15、-β1的表達:與模型組比較，正常對照組、MAT治療組大鼠血清IL-4、TGF-β1表達水平均升高(p＜0.01);與正常對照組相比，MAT治療組大鼠血清IL-4、TGF-β1表達水平有所升高(p＜0.01);MAT-L組表達水平低于MAT-M組、MAT-H組(p＜0.01)，MAT-M組表達水平低于MAT-H組(p＜0.01);與正常對照組比較，模型組、MAT治療組大鼠血清IL-5、IL-10表達水平均升高(p＜0.01);與模型組比較

16、，MAT治療組大鼠血清IL-5、IL-10表達水平均升高(p＜0.01);MAT-H組表達水平高于MAT-M組、MAT-L組(p＜0.01)，MAT-M組表達水平高于MAT-L組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 苦參素(MAT)對EAEWistar大鼠有明顯的防治作用，其可能的免疫作用機制是通過抑制大鼠脊髓中黏附分子，血清中趨化因子的表達，下調(diào)脊髓中TLR4及血清中MD-2的表達，上調(diào)血清中IL-4、IL-5、IL