普羅布考對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠血腦屏障的干預作用及可能機制.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性脫髓鞘疾病，其確切的病因及發(fā)病機制尚不清楚。完整的血-腦屏障（blood-brain barrier, BBB）是神經(jīng)組織發(fā)揮正常功能的重要前提。MS發(fā)病時在炎性細胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS之前，必須先穿過BBB，一旦BBB遭到破壞則不能維持CNS的自穩(wěn)狀態(tài)，這可能就是MS發(fā)病的基礎。實驗

2、性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)與人類MS在臨床、免疫及病理等多方面有相同特征，是國際公認的研究MS的理想動物模型。
　　 緊密連接(tight junction，TJ)構成了BBB的第一道屏障。TJ由跨膜蛋白(occludin)、胞漿附著蛋白(ZO)與細胞骨架蛋白(actin)相連而組成。ZO在連接occludin和actin中起橋梁作用，其中Z

3、O1分布于多種上皮細胞和內(nèi)皮細胞的閉鎖小帶中，它可以敏感地反應出病理情況下屏障的損害，是檢測內(nèi)皮細胞屏障結構和功能的良好指標。
　　 免疫學因素及氧化應激在MS發(fā)病中起著關鍵性作用。近年來隨著對Th17細胞的深入研究人們發(fā)現(xiàn)氧化應激失衡、IL-23/IL-17炎性軸對MS起著重要的作用。普羅布考是一種被攝入后能夠富積于LDL并易于進入動脈內(nèi)膜的抗氧化的物質，主要用于降脂，但其同時能夠調(diào)節(jié)炎性因子，發(fā)揮抗炎作用。普羅布考作為抗氧化

4、物質，能否影響MS的發(fā)病及作用的靶點尚未見報道。本實驗擬通過觀察普羅布考對EAE大鼠干預后血腦屏障損傷指標、免疫學及氧化應激指標的相應動態(tài)變化，觀察其是否對EAE發(fā)病具有保護作用，從而為臨床治療MS提供新的思路。
　　 方法:
　　 (1)動物分組:將120只雌性，6-8周齡，體重200g左右的Wistar大鼠，隨機分為正常對照組，EAE組，普羅布考-EAE組（500mg/kg/d灌胃），醋酸潑尼松-EAE組（5mg/k

5、g/d灌胃），每組30只。每組按免疫后0，3，7，10，14，21天6個時間點，隨機分為6個亞組，每個亞組5只。
　　 (2)動物模型的建立:取體重350 g左右清潔級雌性豚鼠全脊髓，按脊髓重量與冰鹽水體積為1∶10，制成脊髓勻漿，再與等量完全福氏佐劑充分混合，佐劑中含卡介苗為6mg/ml。冰上抽打制成油包水乳劑，乳化后按0.5ml/只分別于大鼠四肢足墊及背部皮下注射，建立EAE動物模型。藥物治療組在模型制備的當天給予相應劑量的

6、藥物灌胃，每天1次，直至動物處死。
　　 (3)神經(jīng)功能評分:免疫當天及免疫后每天，觀察動物精神狀態(tài)、活動情況及稱重，并進行神經(jīng)功能評分。評分采用國際通用的Kono評分標準。
　　 (4)檢測指標:冠狀位取大鼠腦組織中視交叉前后2mm組織制作石蠟包塊，用免疫組織化學法測定ZO-1的表達。ELISA試劑盒檢測血清IL-23及MDA含量。
　　 結果:
　　 (1)大鼠發(fā)病情況:抗原免疫誘導后7天內(nèi)各組無大鼠

7、發(fā)病，11天左右EAE組逐漸出現(xiàn)精神萎靡，食欲不振，體重減輕，皮毛不光滑等情況，12～14天發(fā)病達高峰，17～21天癥狀逐漸緩解。普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組大鼠發(fā)病時間較EAE組推遲(13.20±0.84vs11.89±0.06，14.50±0.58vs11.89±0.06; P＜0.05)，第14天時神經(jīng)功能評分較EAE組減小（1.00±1.15vs2.80±1.40，0.80±1.14vs2.80±1.40; P＜0.

8、05）。正常對照組無大鼠發(fā)病。
　　 (2)組織病理學改變:同時選取對照組、EAE組、普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組大鼠脊髓腰膨大處組織行HE染色，在光鏡下觀察其病理變化。我們發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠在7天時已經(jīng)出現(xiàn)炎性細胞浸潤，14天時脊髓炎性細胞浸潤最為明顯，在血管周圍可見“袖套樣”浸潤。普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE組也可見炎性細胞浸潤，但浸潤程度較EAE組明顯減輕。
　　 (3)免疫組化結果:EAE組ZO

9、-1陽性細胞數(shù)呈先下降后上升的趨勢，7天組明顯下降，14天組下降達高峰，21天組緩慢上升。ZO-1下降達高峰時大鼠癥狀最重，提示臨床與病理結果一致，并且在發(fā)病前已有神經(jīng)功能損傷。EAE組ZO-1陽性細胞數(shù)7天組與3天組比較明顯下降(0.1770±0.0354vs0.2562±0.0133，P＜0.05)，10天較7天時下降不明顯(0.1517±0.0158vs0.1770±0.0354，P＞0.05)，10天與3天比較明顯下降(0.15

10、17±0.0158vs0.2562±0.0133，P＜0.05); EAE14天組較同組其余亞組下降明顯(P＜0.05); EAE組在14天、21天較同期普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE組明顯下降(P＜0.05)。
　　 (4)血清IL-23含量比較:血清IL-23含量比較:在免疫10天、14天、21天時EAE組IL-23的含量較同期對照組明顯升高(161.99±56.25 pg/ml vs77.98±10.41 pg/ml

11、，195.04±88.52 pg/ml vs81.11±16.49 pg/ml,127.19±26.02 pg/ml vs79.17±14.14 pg/ml，P＜0.05）;免疫10天時EAE組大鼠IL-23的含量出現(xiàn)明顯升高，14天時仍有升高但較10天時無統(tǒng)計學意義。而普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組較同期對照組變化不大(P＞0.05）。普羅布考-EAE與醋酸潑尼松-EAE兩組間在各時間點比較IL-23含量變化不明顯(P＞0.

12、05)。
　　 (5)血清MDA含量比較:在免疫10天、14天、21天時EAE組MDA的含量較同期對照組明顯升高(6.63±0.39nmol/ml vs4.84±0.06nmol/ml，9.34±0.40nmol/ml vs4.82±0.07nmol/ml,5.20±0.13nmol/ml vs4.82±0.11nmol/ml,P＜0.05）;而在0天、3天、7天時EAE組MDA的含量較同期對照組變化不大(4.80±0.20nm

13、ol/ml vs4.79±0.78nmol/ml，4.84±0.13nmol/ml vs4.78±0.11 nmol/ml，4.93±0.14nmol/ml vs4.82±0.08nmol/ml，P＞0.05)。免疫10天、14天時除普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE兩組間無明顯差異(P＞0.05）外，其余各組間兩兩比較差異明顯（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1、EAE大鼠臨床發(fā)病前就有血腦屏障的破壞。

14、　　 2、EAE發(fā)病高峰期ZO-1下降最明顯，上調(diào)ZO-1的表達，進而保護血腦屏障是普羅布考可能的機制之一。
　　 3、普羅布考可以推遲EAE大鼠的發(fā)病時間，減輕疾病對神經(jīng)系統(tǒng)功能損害。
　　 4、普羅布考能夠抑制EAE大鼠血清IL-23的表達水平，減少MDA的產(chǎn)生，提示普羅布考治療MS的機制可能與此有關。
　　 5、普羅布考與醋酸潑尼松相比，雖然醋酸潑尼松在推遲發(fā)病時間上優(yōu)于普羅布考，但普羅布考更安全，耐受性