普羅布考對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠血腦屏障的干預(yù)作用及可能機(jī)制.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性脫髓鞘疾病，其確切的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。完整的血-腦屏障（blood-brain barrier, BBB）是神經(jīng)組織發(fā)揮正常功能的重要前提。MS發(fā)病時(shí)在炎性細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS之前，必須先穿過(guò)BBB，一旦BBB遭到破壞則不能維持CNS的自穩(wěn)狀態(tài)，這可能就是MS發(fā)病的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)

2、性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)與人類MS在臨床、免疫及病理等多方面有相同特征，是國(guó)際公認(rèn)的研究MS的理想動(dòng)物模型。
　　 緊密連接(tight junction，TJ)構(gòu)成了BBB的第一道屏障。TJ由跨膜蛋白(occludin)、胞漿附著蛋白(ZO)與細(xì)胞骨架蛋白(actin)相連而組成。ZO在連接occludin和actin中起橋梁作用，其中Z

3、O1分布于多種上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的閉鎖小帶中，它可以敏感地反應(yīng)出病理情況下屏障的損害，是檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞屏障結(jié)構(gòu)和功能的良好指標(biāo)。
　　 免疫學(xué)因素及氧化應(yīng)激在MS發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用。近年來(lái)隨著對(duì)Th17細(xì)胞的深入研究人們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激失衡、IL-23/IL-17炎性軸對(duì)MS起著重要的作用。普羅布考是一種被攝入后能夠富積于LDL并易于進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜的抗氧化的物質(zhì)，主要用于降脂，但其同時(shí)能夠調(diào)節(jié)炎性因子，發(fā)揮抗炎作用。普羅布考作為抗氧化

4、物質(zhì)，能否影響MS的發(fā)病及作用的靶點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察普羅布考對(duì)EAE大鼠干預(yù)后血腦屏障損傷指標(biāo)、免疫學(xué)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的相應(yīng)動(dòng)態(tài)變化，觀察其是否對(duì)EAE發(fā)病具有保護(hù)作用，從而為臨床治療MS提供新的思路。
　　 方法:
　　 (1)動(dòng)物分組:將120只雌性，6-8周齡，體重200g左右的Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，EAE組，普羅布考-EAE組（500mg/kg/d灌胃），醋酸潑尼松-EAE組（5mg/k

5、g/d灌胃），每組30只。每組按免疫后0，3，7，10，14，21天6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)分為6個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。
　　 (2)動(dòng)物模型的建立:取體重350 g左右清潔級(jí)雌性豚鼠全脊髓，按脊髓重量與冰鹽水體積為1∶10，制成脊髓勻漿，再與等量完全福氏佐劑充分混合，佐劑中含卡介苗為6mg/ml。冰上抽打制成油包水乳劑，乳化后按0.5ml/只分別于大鼠四肢足墊及背部皮下注射，建立EAE動(dòng)物模型。藥物治療組在模型制備的當(dāng)天給予相應(yīng)劑量的

6、藥物灌胃，每天1次，直至動(dòng)物處死。
　　 (3)神經(jīng)功能評(píng)分:免疫當(dāng)天及免疫后每天，觀察動(dòng)物精神狀態(tài)、活動(dòng)情況及稱重，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分采用國(guó)際通用的Kono評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。
　　 (4)檢測(cè)指標(biāo):冠狀位取大鼠腦組織中視交叉前后2mm組織制作石蠟包塊，用免疫組織化學(xué)法測(cè)定ZO-1的表達(dá)。ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-23及MDA含量。
　　 結(jié)果:
　　 (1)大鼠發(fā)病情況:抗原免疫誘導(dǎo)后7天內(nèi)各組無(wú)大鼠

7、發(fā)病，11天左右EAE組逐漸出現(xiàn)精神萎靡，食欲不振，體重減輕，皮毛不光滑等情況，12～14天發(fā)病達(dá)高峰，17～21天癥狀逐漸緩解。普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組大鼠發(fā)病時(shí)間較EAE組推遲(13.20±0.84vs11.89±0.06，14.50±0.58vs11.89±0.06; P＜0.05)，第14天時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分較EAE組減?。?.00±1.15vs2.80±1.40，0.80±1.14vs2.80±1.40; P＜0.

8、05）。正常對(duì)照組無(wú)大鼠發(fā)病。
　　 (2)組織病理學(xué)改變:同時(shí)選取對(duì)照組、EAE組、普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組大鼠脊髓腰膨大處組織行HE染色，在光鏡下觀察其病理變化。我們發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠在7天時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，14天時(shí)脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最為明顯，在血管周圍可見(jiàn)“袖套樣”浸潤(rùn)。普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE組也可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但浸潤(rùn)程度較EAE組明顯減輕。
　　 (3)免疫組化結(jié)果:EAE組ZO

9、-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)，7天組明顯下降，14天組下降達(dá)高峰，21天組緩慢上升。ZO-1下降達(dá)高峰時(shí)大鼠癥狀最重，提示臨床與病理結(jié)果一致，并且在發(fā)病前已有神經(jīng)功能損傷。EAE組ZO-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)7天組與3天組比較明顯下降(0.1770±0.0354vs0.2562±0.0133，P＜0.05)，10天較7天時(shí)下降不明顯(0.1517±0.0158vs0.1770±0.0354，P＞0.05)，10天與3天比較明顯下降(0.15

10、17±0.0158vs0.2562±0.0133，P＜0.05); EAE14天組較同組其余亞組下降明顯(P＜0.05); EAE組在14天、21天較同期普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE組明顯下降(P＜0.05)。
　　 (4)血清IL-23含量比較:血清IL-23含量比較:在免疫10天、14天、21天時(shí)EAE組IL-23的含量較同期對(duì)照組明顯升高(161.99±56.25 pg/ml vs77.98±10.41 pg/ml

11、，195.04±88.52 pg/ml vs81.11±16.49 pg/ml,127.19±26.02 pg/ml vs79.17±14.14 pg/ml，P＜0.05）;免疫10天時(shí)EAE組大鼠IL-23的含量出現(xiàn)明顯升高，14天時(shí)仍有升高但較10天時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而普羅布考-EAE組、醋酸潑尼松-EAE組較同期對(duì)照組變化不大(P＞0.05）。普羅布考-EAE與醋酸潑尼松-EAE兩組間在各時(shí)間點(diǎn)比較IL-23含量變化不明顯(P＞0.

12、05)。
　　 (5)血清MDA含量比較:在免疫10天、14天、21天時(shí)EAE組MDA的含量較同期對(duì)照組明顯升高(6.63±0.39nmol/ml vs4.84±0.06nmol/ml，9.34±0.40nmol/ml vs4.82±0.07nmol/ml,5.20±0.13nmol/ml vs4.82±0.11nmol/ml,P＜0.05）;而在0天、3天、7天時(shí)EAE組MDA的含量較同期對(duì)照組變化不大(4.80±0.20nm

13、ol/ml vs4.79±0.78nmol/ml，4.84±0.13nmol/ml vs4.78±0.11 nmol/ml，4.93±0.14nmol/ml vs4.82±0.08nmol/ml，P＞0.05)。免疫10天、14天時(shí)除普羅布考-EAE、醋酸潑尼松-EAE兩組間無(wú)明顯差異(P＞0.05）外，其余各組間兩兩比較差異明顯（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、EAE大鼠臨床發(fā)病前就有血腦屏障的破壞。

14、　　 2、EAE發(fā)病高峰期ZO-1下降最明顯，上調(diào)ZO-1的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)血腦屏障是普羅布考可能的機(jī)制之一。
　　 3、普羅布考可以推遲EAE大鼠的發(fā)病時(shí)間，減輕疾病對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能損害。
　　 4、普羅布考能夠抑制EAE大鼠血清IL-23的表達(dá)水平，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，提示普羅布考治療MS的機(jī)制可能與此有關(guān)。
　　 5、普羅布考與醋酸潑尼松相比，雖然醋酸潑尼松在推遲發(fā)病時(shí)間上優(yōu)于普羅布考，但普羅布考更安全，耐受性