姜黃素對實驗性自身免疫性重癥肌無力的治療研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 姜黃素對實驗性自身免疫性重癥肌無力的治療研究
　　目的:
　　探討姜黃素對實驗性自身免疫性重癥肌無力的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.建立EAMG模型及臨床分級
　　選擇健康、SPF級別、雌性Lewis大鼠，一般6-8周齡，體重160-180 g。用H37Ra株熱滅活結核桿菌和不完全弗氏佐劑溶解人工合成的大鼠來源的AChR-α亞基97-116肽段合成

2、免疫乳劑，每只大鼠在雙后足墊皮下注射200μl乳劑，然后在免疫11天后于每只大鼠背部再次免疫1次，作為強化免疫。每間隔一天采用Lennon臨床評分量表對每只大鼠進行臨床分級和稱重，直至發(fā)病高峰第45天，這個過程需要采用雙盲法。
　　2.EAMG大鼠的分組與治療
　　將18只Lewis大鼠每6只一組，隨機分成姜黃素小劑量治療組(50mg/kg)和姜黃素大劑量治療組(100mg/kg)和EAMG對照組（同體積PEG）。于EAMG

3、大鼠發(fā)病第11日起開始，隔日給予姜黃素及等體積的PEG腹腔注射，直至大鼠發(fā)病高峰期笫45天。
　　3.制備淋巴結單個核細胞(mononuclear cells，MNC)
　　在EAMG大鼠發(fā)病高峰期，無菌操作下分離、獲取各組大鼠腹股溝淋巴結，通過研磨過濾、離心，制備MNC懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)，通過計算，最終獲取細胞濃度為2×106個細胞/ml的細胞懸液。
　　4.流式細胞術檢測淋巴結單個核細胞中的細胞因子
　

4、　取大鼠腹股溝淋巴結制備單細胞懸液，加入細胞刺激阻斷劑，培養(yǎng)4h后收集細胞，標記CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)、CD4+ IL-17+(Th17)和CD4+Foxp3+(Treg)細胞，及細胞因子TNF-α、IL-10，用流式細胞儀檢測。
　　結果:
　　1.姜黃素可緩解EAMG大鼠的癥狀
　　與未經(jīng)治療的EAMG對照組相比，姜黃素治療的EAMG大鼠臨床癥狀明顯緩解。與且EAMG對照組相比

5、，大劑量姜黃素組在發(fā)病后第23天，27天，29天，33天，35天，37天，39天，41天，43天和45天均明顯減輕了大鼠的臨床癥狀。小劑量姜黃素組在發(fā)病后第29天，31天，43天and45天與對照組相比明顯減輕了臨床癥狀。
　　2.姜黃素抑制EAMG大鼠淋巴結單個核細胞上CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達與EAMG對照組相比，大劑量姜黃素治療組中大鼠淋巴結單個核細胞上CD80及MHC-Ⅱ的表達均顯著降低。兩組姜黃素治療組的淋巴結

6、單個核細胞上CD86的表達與EAMG對照組相比均明顯降低。
　　3.姜黃素對EAMG大鼠淋巴結單個核細胞中細胞因子的影響
　　用流式細胞術檢測大鼠淋巴結單個核細胞中的CD4+IFN-γ+(Th1)細胞、CD4+IL-4+(Th2)細胞、CD4+IL-17+(Th17)細胞和CD4+Foxp3+(Treg)比例發(fā)現(xiàn)，姜黃素治療后Th1、Th2、Th17、Treg的細胞比例有明顯變化，抑制了疾病的免疫進展。另外，用流式細胞術檢測

7、各組淋巴結單個核細胞中IFN-γ、TNF-α、IL-10及1L-17細胞因子，與EAMG對照組相比，兩組姜黃素治療組大鼠MNC中的IFN-γ顯著降低，IL-10的表達明顯增加。小劑量姜黃素治療組與對照組相比，IL-17和TNF-α表達顯著下降;大劑量治療組的IL-17和TNF-α表達亦下降，但沒有統(tǒng)計學差異。
　　4.姜黃素上調(diào)了淋巴結單個核細胞中NK細胞與NKT細胞的數(shù)量
　　姜黃素治療后，高劑量治療組的NK（CD3-CD

8、161a+）細胞的數(shù)量與EAMG對照組相比明顯升高。與對照組相比，兩組姜黃素治療后NKT(CD3+CD161a+)細胞數(shù)量顯著升高。
　　5.姜黃素的上調(diào)了淋巴結單個核細胞中B10細胞的數(shù)量
　　姜黃素治療后，與EAMG對照組相比，大劑量姜黃素治療組中B10(CD19+IL10+)細胞數(shù)量顯著升高，小劑量姜黃素治療組B10細胞亦升高，但沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　1.姜黃素治療有效緩解了EAMG大鼠的臨床癥

9、狀。
　　2.姜黃素治療抑制了EAMG大鼠T細胞表面共刺激因子CD80、CD86和MHCclass-Ⅱ的表達。
　　3.姜黃素治療抑制了促炎細胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生，上調(diào)了抑炎細胞因子IL-10的表達，促進Th細胞由Th1/Th17型向Th2/Treg型分化。
　　4.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)NK細胞和NKT細胞的數(shù)量。
　　5.姜黃素治療促進B細胞分化為B10細胞。
　　6

10、.姜黃素治療增加了EAMG大鼠體內(nèi)保護性抗體IgG1的數(shù)量并且減少病理性抗體的總親和力。
　　第二部分 新型煙堿對實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的治療研究
　　目的:
　　我們給予EAN大鼠新型煙堿治療，并研究其對大鼠自身免疫調(diào)節(jié)作用的機制。結果發(fā)現(xiàn)新型煙堿可以改善EAN疾病的臨床癥狀，減少了坐骨神經(jīng)炎性細胞的浸潤，下調(diào)了細胞因子IL-10與IFN-γ的表達，上調(diào)了Treg細胞的表達，增加的NK細胞的數(shù)量。綜上結果表明，新型煙

11、堿有效的緩解了自身免疫性神經(jīng)炎模型大鼠的疾病癥狀，為治療格林-巴利綜合征提供了新選擇。
　　方法:
　　1.EAN模型的建立及臨床評分
　　從新鮮牛尾中提取抗原BPM，采用健康、SPF級別、6-8周雌性lewis大鼠，150-170g，將BPM溶于H37Ra株熱滅活結核桿菌和不完全弗氏佐劑中，充分混勻制備成免疫溶劑。大鼠雙后足墊皮下注射免疫溶劑造模，每只大鼠用量為200μl。注射當天定為第0天，雙盲法臨床評分，每日稱重

12、，直至發(fā)病高峰第16天。
　　2.動物分組及藥物干預
　　將15只大鼠隨機分為三組，每組5只且體重平均數(shù)基本一致。三組分別為小劑量治療組(2 mg/kg)、大劑量治療組(20 mg/kg)和EAN對照組（同體積蒸餾水）。治療組于免疫后5第天開始用灌胃法給予新型煙堿藥物治療，直至免疫后第16天。對照組灌胃給予相同體積的蒸餾水。
　　3.組織病理學檢測
　　在發(fā)病高峰期水合氯醛麻醉后脫臼處死大鼠，取坐骨神經(jīng)置于10％

13、多聚甲醛中固定，石蠟包埋后常規(guī)切片，然后依次經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染色、0.5％伊紅液染色、脫水、透明、封片等步驟處理。顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)中炎性細胞的浸潤情況，并計數(shù)統(tǒng)計。
　　4.制備淋巴結單個核細胞(mononuclear cells，MNC)
　　無菌操作下分離大鼠腹股溝淋巴結，用玻璃棒研磨、細胞濾器過濾、離心后制備單個核細胞懸液，細胞計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整獲得細胞濃度為2×106個細胞/ml的細胞懸液。
　　5.流式

14、檢測Treg細胞的比例
　　取調(diào)整好濃度的淋巴結MNC懸液，加入標記的CD25抗體和CD4抗體，孵育30min后加入固定破膜工作液，避光孵育過夜，次日后洗滌細胞加入PE-cy5標記的Foxp3抗體靜置30min后，重懸過濾細胞后上機流式細胞儀檢測。
　　結果:
　　1.三組大鼠的發(fā)病癥狀與臨床評分
　　三組老鼠均在第16天達到發(fā)病高峰，與對照組相比，兩組新型煙堿治療組大鼠的臨床癥狀明顯改善.與對照組相比，大劑量煙

15、堿治療組的臨床評分從免疫后的第11天到16天均顯著降低。小劑量煙堿治療組的臨床評分也有降低，在免疫后第11天、第14天、第15天、第16天與對照組相比具有統(tǒng)計學差異。兩組治療組間評分無明顯差異。
　　2.新型煙堿治療減少了EAN大鼠坐骨神經(jīng)中炎性細胞浸潤的情況與EAN對照組相比，大劑量煙堿治療組(20mg/kg)和小劑量煙堿治療組(2mg/kg)大鼠坐骨神經(jīng)均可見炎性細胞浸潤減少，且大劑量治療組與小劑量治療組相比可見更少的炎性細胞

16、浸潤。
　　3.新型煙堿抑制了EAN大鼠IL-10、IFN-γ的表達
　　用流式細胞術檢測大鼠淋巴結單個核細胞中的IL-10、IFN-γ、IL-17細胞因子的表達。與EAN對照組相比，兩組新型煙堿治療組的IL-10表達均下降，大劑量新型煙堿治療后細胞因子IFN-γ表達明顯下降，小劑量組IFN-γ表達亦下降但沒有統(tǒng)計學意義。兩組新型煙堿治療后IL-17表達均下降，但與對照組相比沒有顯著統(tǒng)計學差異。
　　4.新型煙堿治療上

17、調(diào)了淋巴結MNC中Treg細胞的表達
　　用流式細胞術檢測大鼠淋巴結單個核細胞中Treg細胞的表達情況。結果顯示，與EAN對照組相比，大劑量煙堿治療組上調(diào)了CD4+Foxp3+細胞的數(shù)量，小劑量煙堿治療組中CD4+Foxp3+細胞數(shù)量亦上升，但沒有統(tǒng)計學差異。
　　5.新型煙堿治療的增加了MNC中NK細胞的數(shù)量
　　用流式細胞術檢測大鼠淋巴結單個核細胞中NK細胞的表達情況。與EAN對照組相比，大劑量新型煙堿治療組CD3

18、-CD161a+(NK)細胞數(shù)量增加，小劑量煙堿治療組中NK細胞有升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)，給予EAN大鼠新型煙堿治療后可有效緩解大鼠的臨床癥狀，藥物通過抑制坐骨神經(jīng)炎性細胞的浸潤，降低淋巴結MNC的CD80的表達，上調(diào)淋巴結單個核細胞中Treg細胞的數(shù)量，抑制IL-10與IFN-γ細胞因子的表達，增加的NK細胞數(shù)量幾個方面發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用，本實驗為臨床上治療人類GBS提供了一種新策略和新方