骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力的治療作用及可能機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 1、建立Lewis大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，探討β-巰基乙醇定向誘導(dǎo)其向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的可行性，并觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶GFAP的表達(dá)。
　　 2、腹腔輸注mAb35以探討建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMGExperimental autoimmune myasthenia gravis)的方法。
　　 3、探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(B

2、MSCs)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(EAMG)的治療作用及TSG-6（tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6）、MMP-9在其作用中發(fā)揮的可能機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床治療提供一定的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、BMSCs用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)獲得，觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞表面的CD90、CD29、CD45等標(biāo)志抗原的表達(dá)率，然后用化學(xué)誘導(dǎo)劑

3、β-ME定向誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)和WB檢測(cè)，觀察細(xì)胞表面NSE及GFAP的表達(dá)情況，與未誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)建立EAMG動(dòng)物模型的方法選用的是腹腔輸注mAb35，其是一種AChR特異性單克隆抗體，動(dòng)物成功建模后應(yīng)用HE染色法觀察兩組大鼠腓腸肌冰凍切片中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，并且應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察大鼠肌肉切片中的AChR數(shù)量的改變情況，并分別收集兩組大鼠的血清，采用間接ELIS

4、A方法檢測(cè)兩組大鼠血清中AChR-Ab含量。
　　 3、選取清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)的Lewis雌性大鼠30只，將其分為BMSCs移植組(n=10)、EAMG模型對(duì)照組(n=10)和正常對(duì)照組(n=10)。移植組和模型對(duì)照組腹腔注射mAb35建立EAMG模型。分離培養(yǎng)Lewis大鼠的BMSCs進(jìn)行鑒定后，調(diào)整密度至1.5×106/600μL PBS，移植組尾靜脈注射細(xì)胞懸液600μL，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組同期給予600μL PBS。對(duì)

5、3組動(dòng)物進(jìn)行Lennon臨床評(píng)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)ELISA法檢測(cè)血清中AChR-Ab含量，免疫熒光技術(shù)觀察腓腸肌AChR數(shù)量的變化，應(yīng)用real time RT-PCR研究腓腸肌AChRα、MMP-9 mRNA的表達(dá)。體外用10ng/ml TNF-α培養(yǎng)BMSCs24h后用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清TSG-6，并用realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TSG-6 mRNA表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下的BMS

6、Cs形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主，流式細(xì)胞儀結(jié)果示細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD29、CD45的表達(dá)率分別為99.04％、98.53％、0.01％;化學(xué)誘導(dǎo)劑β巰基乙醇誘導(dǎo)后的細(xì)胞其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了相應(yīng)的變化，原本呈長(zhǎng)梭形的細(xì)胞胞體收縮成球形或者不規(guī)則形狀，顯微鏡下所見(jiàn)細(xì)胞的折光性較前有明顯增強(qiáng)，較多的長(zhǎng)突起出現(xiàn)在細(xì)胞胞體上，顯微鏡下這些突起類似于神經(jīng)元樣細(xì)胞的樹(shù)突和軸突;免疫細(xì)胞化學(xué)染色示NSE陽(yáng)性表達(dá)率為57.6％±8.2％，而GFAP表達(dá)為陰性;

7、WB結(jié)果示誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE表達(dá)量增加。
　　 2、實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔被動(dòng)輸注mAb35上清成功建立了EAMG大鼠動(dòng)物模型，該方法的成模率為100％，光鏡下發(fā)現(xiàn)PTMG組肌肉冰凍切片中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，熒光顯微鏡下可見(jiàn)PTMG組肌肉切片中AChR表達(dá)量明顯下調(diào)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果示PTMG組血清中的AChR-Ab含量明顯高于健康對(duì)照組。
　　 3、移植組Lennon評(píng)分、AChR-Ab含量、AChR mRNA表達(dá)均低于模型對(duì)照

8、組(P＜0.05);免疫熒光檢測(cè)示模型對(duì)照組未見(jiàn)紅色熒光，移植組大鼠可見(jiàn)斷斷續(xù)續(xù)較為微弱的熒光;TNF-α處理的BMSCs分泌的TSG-6含量明顯增高(P＜0.01)，TSG-6 mRNA表達(dá)量也增高(P＜0.05);模型對(duì)照組MMP-9表達(dá)提高（vs正常對(duì)照組P＜0.05）;而移植組vs正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、全骨髓培養(yǎng)法可以獲得穩(wěn)定且高純度的BMSCs;β-巰基乙醇能夠在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)