過表達(dá)ICAM-1間充質(zhì)干細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（Experimental autoimmune thyroiditis，EAT）模型，給予不同MSC治療，通過檢測各種指標(biāo)，觀察各組MSC對EAT的療效。
　　2.用氯甲基苯甲酰氨（CM-Dil）染色各組MSC，觀察輸注的MSC在體內(nèi)的分布。
　　3.提取各組脾細(xì)胞蛋白，western blot檢測各組ERK及P38通路改變，探討MSC發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法：

2、r>　　1.訂購6周齡雌性C57BL/6小鼠60只，于動物中心喂養(yǎng)1周后，建立自身免疫性甲狀腺炎（EAT）模型。共分為6組，每組10只，除正常組外，其他各組均于第0天和第14天用豬甲狀腺免疫球蛋白(Porcine Thyroglobulin，PTg)分別與完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant complete， CFA）及非完全弗式佐劑(Freund’s adjuvant incomplete，IFA）等體積充分混勻乳化后，

3、皮下多點(diǎn)免疫小鼠，建立EAT模型；治療組于第0天和第14天給予3×105 MSC/只相應(yīng)細(xì)胞治療，正常組及模型組尾靜脈注射等量生理鹽水作為對照，第28天稱取各組小鼠體重，摘眼球取血，測血清TT3、TT4、TSH、TGAb、TPOAb、TMAb水平，并分離甲狀腺組織，行HE染色，觀察各組甲狀腺破壞嚴(yán)重程度，取各組小鼠脾臟，并稱重，計算脾臟指數(shù)（脾臟重量mg/體重g），碾碎脾臟，裂解紅細(xì)胞、洗滌，得到單個核細(xì)胞，加入TRIzol試劑，提取R

4、NA，逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA后進(jìn)行q-PCR檢測炎性因子IL-4、IL-10、IL-17、INF-γ的表達(dá)水平；另外，取模型小鼠的脾細(xì)胞，體外與各組MSC共培養(yǎng)，檢測上述炎性因子的表達(dá)水平。
　　2.訂購6周齡雌性C57BL/6小鼠60只，運(yùn)用豬甲狀腺球蛋白及弗式佐劑建立模型后，于第0天及第14天給予相應(yīng)治療，治療前用CM-Dil染色各組MSC細(xì)胞，尾靜脈注射3×105個MSC/只相應(yīng)細(xì)胞，第28天收集標(biāo)本，麻醉小鼠，心臟灌流，取甲狀

5、腺及肺臟組織，制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察各組 MSC在甲狀腺及肺臟的分布。
　　3.取上述的各組小鼠脾臟單個核細(xì)胞5×106，加入細(xì)胞裂解液80ul，提取胞漿蛋白，BCA法測蛋白濃度，western blot檢測各組MAPK信號通路中的P38及ERK通路有無改變。
　　結(jié)果：
　　1.血清甲狀腺相關(guān)激素及抗體檢測結(jié)果顯示，模型組TPOAb、TGAb、TMAb、TSH均較正常組高，治療組較模型組均有所下降，但C3H1

6、0T1/2-ICAM-1/MSC組較C3H10T1/2-MIGR1/MSC組下降明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），模型組 TT4的水平較正常組低，治療組均較模型組有所上升， C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組較C3H10T1/2-MIGR1/MSC組上升明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。甲狀腺HE染色結(jié)果顯示模型組甲狀腺濾泡破壞，大小不均，上皮細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤，C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組及原代

7、MSC組甲狀腺破壞明顯減輕，上皮增生減少，炎性浸潤減少，其他治療組炎性浸潤的改善不明顯。模型組脾臟指數(shù)明顯高于正常組(P<0.01)，C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組較C3H10T1/2-MIGR1/MSC組脾臟指數(shù)下降，(P<0.01)，而其他治療組脾臟指數(shù)改善不明顯。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)q-PCR檢測炎癥因子，模型組IL-10及IL-4水平均較正常組低，IL-17及INF-γ均較正常高，C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組

8、較C3H10T1/2-MIGR1/MSC組IL-10及IL-4的水平明顯增加，IL-17及INF-γ的分泌明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.MSC歸巢研究顯示C3H10T1/2-ICAM-1/MSC歸巢到甲狀腺最明顯，而原代MSC在肺部滯留最多。
　　3.western blot顯示模型組 ERK及 P38較正常組磷酸化增強(qiáng)，而C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組ERK及P38去磷酸化最明顯。

9、>　　結(jié)論：
　　1.給予C3H10T1/2-ICAM-1/MSC治療組，無論從病理、血清抗體指標(biāo)、炎性因子的改善、脾臟指數(shù)下降情況均說明C3H10T1/2-ICAM-1/MSC組療效最佳。
　　2.MSC歸巢實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C3H10T1/2-ICAM-1/MSC治療組歸巢到甲狀腺最多。故ICAM-1促進(jìn)MSC的體內(nèi)遷移能力。
　　3.C3H10T1/2-ICAM-1/MSC通過使小鼠免疫細(xì)胞內(nèi)P38、ERK的去磷酸化