人羊膜間充質(zhì)干細胞和人羊膜上皮細胞對大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎治療效應及免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖卟?。目前尚無根治方法。人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)和人羊膜上皮細胞(hAECs)具有免疫調(diào)節(jié)作用,為治療MS提供了可能。本研究以大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓(EAE)作為MS的模型,觀察hAMSCs和hAECs的治療效應和免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:①采用胰酶-膠原酶兩步消化法分離培養(yǎng)hAMSCs、hAECs細胞,用流式細胞術(shù)(FCM)和免疫組化進行鑒定。②

2、采用豚鼠脊髓勻漿+完全弗氏佐劑(CFA)+百日咳毒素(PTx)復制EAE大鼠模型。成模動物隨機分為模型組(n=12)、培養(yǎng)基組(n＝6)、hAMSCs治療組(n=12)、hAECs治療組(n=12)和潑尼松治療組(n＝12)。另設(shè)正常組(n=6)作為平行對照。細胞治療組經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射hAMSCs或hAECs懸液10μl/只（含5×105個細胞）,培養(yǎng)基組同樣的途徑注射等體積無血清的L-DMEM培養(yǎng)基,藥物治療組腹腔注射潑尼松25mg/

3、(kg.d)連續(xù)一周。③動態(tài)觀察動物體重變化,采用kono評分觀察行為學改變。④HE染色觀察大鼠腦和脊髓組織病理改變。⑤細胞移植后3周和5周,免疫熒光染色示蹤供體細胞在腦和脊髓組織內(nèi)的分布。⑥細胞移植后3周和5周,流式細胞術(shù)(FCM)檢測大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1和Tc2 T淋巴細胞亞群變化。⑦流式微球芯片捕獲技術(shù)(CBA)檢測血漿細胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10的含量。

4、　　 結(jié)果:①第3代hAMSCs表達CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白陽性,不表達CD14、CD19、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR;第三代hAECs表達CD29、CD44、CD73及CK19陽性,不表達CD34、CD45、CD71、CD80、CD86和HLA-DR。②hAMSCs和hAECs治療組分別于移植后第5天和第3天開始至觀察期結(jié)束,kono評分均明顯低于模型組和培養(yǎng)基組(P＜0.05;

5、P＜0.01);第20天至第35天,hAECs組kono評分明顯低于hAMSCs組(P＜0.05;P＜0.01);第14天至第35天,hAECs組kono評分明顯低于潑尼松組(P＜0.05; P＜0.01)。③與正常組大鼠比較,各組大鼠體重不同程度下降,但hAMSCs和hAECs治療組從移植后9天起,動物體重止降啟穩(wěn),至第5周漸增至移植時體重水平,且明顯高于模型組、培養(yǎng)基組和潑尼松組（均P＜0.05）。④病理檢查可見hAMSCs和hAE

6、Cs治療組腦和脊髓炎性細胞浸潤明顯減輕。⑤免疫熒光染色結(jié)果顯示,hAMSCs組和hAECs組移植后3周和5周,腦和脊髓組織中均有較多人細胞核抗原陽性即hAMSCs和hAECs存活。⑥FCM分析結(jié)果顯示,與模型組比較, hAMSCs治療組、hAECs治療組和潑尼松組Th2、Tc1（CD4-CD8+IFN-γ+）、Tc2(CD4-CD8+IL-4+)和Treg細胞百分率均明顯升高（P＜0.05; P＜0.01）,而Th17顯著下降(均P＜0

7、.01),Th1/Th2和Th17/Treg比值均降低(P＜0.05;P＜0.01);hAMSCs組和hAECs組比較,后者Th1細胞下降和Treg細胞升高更為顯著(P＜0.05); hAMSCs組和hAECs組與潑尼松組比較, Th17細胞下降更明顯(P＜0.01; P＜0.05)。⑦CBA法檢測結(jié)果顯示,與模型組比較,hAMSCs和hAECs治療組第3周和第5周IL-2和IFN-γ含量均明顯降低(P＜0.05;P＜0.01),IL-

8、4和IL-10均顯著升高（P＜0.05;P＜0.01）;與潑尼松組比較,第3周和第5周hAMSCs和hAECs組IL-2的含量均明顯降低（均P＜0.05）,第5周IL-10含量明顯升高(P＜0.05),第5周hAECs組TNF-α明顯減少;hAECs組第5周TNF-α的含量明顯低于hAMSCs組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:hAMSCs和hAECs移植能明顯改善EAE大鼠神經(jīng)功能,其機制可能主要與調(diào)節(jié)淋巴細胞亞群,尤其與上調(diào)F