間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療重癥肌無力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背重癥肌無力(Myasthenia Gravis,MG)是一種自身免疫性疾病,病因和確切的發(fā)病機(jī)理目前仍不清楚。研究普遍認(rèn)為它是依賴于T細(xì)胞,由B細(xì)胞介導(dǎo)的發(fā)生在肌肉接頭處,以自身反應(yīng)性抗體為特征的免疫性疾病。疾病的發(fā)生過程既包括體液免疫也包括AchR特意性的T細(xì)胞免疫。各種免疫細(xì)胞的激活狀態(tài),補(bǔ)體系統(tǒng)的過度活化,以及免疫調(diào)節(jié)的失衡和干細(xì)胞微環(huán)境的改變都存在于自身免疫性疾病中。其中基質(zhì)祖細(xì)胞,內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓微環(huán)境的功能失調(diào)也是自身免疫

2、性疾病的發(fā)生原因之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem cells,MSC)是一類具有自我更新(selfrenewal)和多向分化潛能(multi-lineage differentiation)的成體干細(xì)胞。它是骨髓基質(zhì)的組成成份之一,可以向下分化為脂肪、軟骨等間質(zhì)組織。MSC還有豐富的分泌功能,既能產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子如ICAM-1,LFA-1,又能分泌各種細(xì)胞因子PGE2,IDO等。研究發(fā)現(xiàn),MSC通過細(xì)胞釋放免疫相關(guān)

3、的細(xì)胞因子和細(xì)胞之間直接接觸能夠抑制T細(xì)胞的增殖。此外,MSC還能夠調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫功能。鑒于免疫系統(tǒng)的過渡活化是MG的重要發(fā)病原因,而MSC具有免疫調(diào)節(jié)的能力,應(yīng)用MSC細(xì)胞移植可能是一條治療重癥肌無力嶄新的、有前途的策略。
　　 目的:研究臍帶/骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)對乙酰膽堿受體(AchR)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力模型的治療作用及可能的機(jī)制。為MSC應(yīng)用于自身性免疫病的臨床治

4、療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:建立AchR誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性重癥肌無力(EAMG)的動物模型,觀察不同治療劑量hMSC對EAMG動物模型的療效,包括臨床肌無力評分的情況,體重變化,AchR-T細(xì)胞在體內(nèi)體外的增殖水平。我們應(yīng)用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測了外周血和脾來源的單個(gè)核細(xì)胞中Treg(CD4+CD25+)的比率和CD4+T Foxp3的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR用來檢測淋巴細(xì)胞(CD4+/CD4-)上細(xì)胞因子和共刺激分子在mRNA

5、水平的表達(dá)。我們應(yīng)用ELISA和ELISPOT方法在體內(nèi)和體外分別檢測了血清中自身反應(yīng)性抗體的水平和體外B細(xì)胞原位分泌抗體的水平。此外,我們還應(yīng)用小動物活體成像和免疫熒光標(biāo)記的方法MSC在EAMG體內(nèi)的遷移情況。在體外實(shí)驗(yàn)中,我們還應(yīng)用Transwell方法研究了當(dāng)MSC與免疫細(xì)胞直接接觸或不直接接觸時(shí),對CD4細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和其表面的黏附分子表達(dá)情況的影響作用。
　　 結(jié)果:首先我們采用兩種治療方案,方案一在第一次和第二次主

6、動免疫后第四天給與1×106MSC尾靜脈注射,方案二我們采用的治療劑量是1×107,治療時(shí)間選擇的是第二次免疫后的第1,3,5天的大劑量連續(xù)的hMSC靜脈注射時(shí),我們發(fā)現(xiàn)方案二治療組臨床評分比對照組沒有出現(xiàn)明顯降低。我們檢測血清中抗體的水平時(shí)發(fā)現(xiàn),治療組和對照組也沒有明顯差異。我們發(fā)現(xiàn)方案一的MSC能夠特意性的遷移到炎癥和免疫器官并明顯降低EAMG的的臨床評分。并且在第二次治療后的第10天,檢測血清中抗體發(fā)現(xiàn)hMSC治療組血清抗體水平低

7、于實(shí)驗(yàn)組。體外對B細(xì)胞原位分泌抗體情況的檢測也證實(shí),hMSC能明顯抑制B細(xì)胞分泌產(chǎn)生AchR抗體。體內(nèi)和體外檢測hMSC對AchR特意性的T細(xì)胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)hMSC在體內(nèi)和體外都能抑制T細(xì)胞的增殖。MSC還能上調(diào)Treg細(xì)胞的比率,增加CD4+T內(nèi)Foxp3的表達(dá)。檢測細(xì)胞因子mRNA水平發(fā)現(xiàn),MSC組中IL-10比EAMG組有升高的趨勢,而MSC組趨化因子IP-10的水平則相對EAMG組降低。我們還檢測了來自外周血和脾的淋巴細(xì)胞上