基于Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的COLd-PCR用于KRAS突變快速篩查的研究.pdf

1、臨床上及早發(fā)現(xiàn)基因突變對腫瘤的個體化治療有著非常重要的意義。目前，常規(guī)PCR+Sanger測序檢測突變應(yīng)用最為廣泛，但該法只能檢測含量在15％-20％以上的突變基因，并且操作繁瑣、價格昂貴，其它方法也各有不足，現(xiàn)缺少一種簡便、快速、價廉、靈敏、儀器常見、可同時對多個突變位點進行初步篩查的方法。為解決上述問題，本文采用基于Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的COLD-PCR（coamplification at lower denatur

2、ation temperature-PCR）用于快速KRAS突變的篩查。其中，COLD-PCR利用DNA雙鏈的熔解溫度與其序列相關(guān)的性質(zhì)，通過改變變性溫度，能在大量野生型基因中選擇性地富集突變基因;Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料法是指在實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)反應(yīng)體系中同時加入DNA結(jié)合染料和針對野生型序列的Taqman探針用于終點熒光信號的檢測。該

3、技術(shù)可選擇性富集和篩選與野生型探針不匹配的各種突變，即可同時篩選多種突變，而不論突變是已知或未知、單個或多個、點突變還是長串突變。KRAS基因突變被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥，檢測KRAS突變的臨床意義重大，本文通過對肺癌中KRAS基因突變的檢測探討該方法的可行性。
　　目的:建立基于Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的COLD-PCR法檢測KRAS基因突變，驗證其可行性，并應(yīng)用于臨床樣本中KRAS突變的快速篩查。

4、>　　方法:1.選取KRAS純合野生型和純合突變型細胞株;設(shè)計特異的引物、針對KRAS野生型序列的探針及突變型序列的探針（均用ROX標(biāo)記）;提取細胞株DNA，用常規(guī)PCR擴增，產(chǎn)物測序驗證基因型。
　　2.用染料(EVAgreen) qPCR法分別擴增KRAS突變型和野生型DNA，逐漸降低變性溫度，以突變DNA有擴增而野生DNA基本無擴增時的變性溫度為COLD-PCR的最佳嚴(yán)格解鏈溫度(critical denaturation

5、temperature，Tc)，建立COLD-PCR循環(huán)條件。
　　3.在染料qPCR體系中加入野生型探針，優(yōu)化體系及常規(guī)PCR循環(huán)條件，建立Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的常規(guī)qPCR法（方法一）。
　　4.在方法一的基礎(chǔ)上，將常規(guī)PCR循環(huán)條件改為COLD-PCR，建立基于Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的COLD-PCR法（方法二）。
　　5.用兩種方法分別擴增不同KRAS突變比例的標(biāo)準(zhǔn)品，記錄EVAgre

6、en染料與ROX標(biāo)記探針的終點熒光強度并計算EVA/ROX比值，分別統(tǒng)計分析三組EVA/ROX的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，計為means+SD。以能準(zhǔn)確檢測到區(qū)別于純野生型KRAS基因EVA/ROX值的最小EVA/ROX值所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品比例為最低檢測限。
　　6.將兩種方法中的野生型探針換成突變型探針，分別擴增不同KRAS突變比例的標(biāo)準(zhǔn)品，觀察染料及突變探針的熒光強度及趨勢，驗證方法一、二可行性。
　　7.收集25例肺癌患者血樣、提

7、取DNA，用兩種方法分別檢測KRAS突變。檢測有KRAS突變的血液樣本，取其余下DNA用常規(guī)PCR試劑盒，以常規(guī)PCR或COLD-PCR循環(huán)條件擴增，再Sanger測序，精確驗證是否有KRAS突變。
　　結(jié)果:1.測序結(jié)果驗證了兩細胞株均含預(yù)期基因型。COLD-PCR時的Tc值為80.5℃。
　　2.兩方法檢測不同比例KRAS突變標(biāo)準(zhǔn)品，得到了終點信號EVA/ROX的means±SD，方法一和方法二最低檢測限分別為10％、5

8、％。比較兩方法的最低檢測限可得:與常規(guī)PCR循環(huán)條件相比，COLD-PCR條件下能更好的富集突變。
　　3.兩方法中野生型探針替換成突變型探針后，觀察到染料和突變探針的熒光強度及趨勢均符合預(yù)期，驗證了兩方法的可行性。
　　4.25例血液樣本中，方法一未檢出KRAS突變，方法二檢出一例有KRAS突變，分析該樣本EVA/ROX的比值，對比方法二標(biāo)準(zhǔn)品的比值，可以半定量的判斷該樣本KRAS突變比例在5％-10％之間。
　　5

9、.方法二檢出有KRAS突變的血樣，常規(guī)PCR條件擴增的產(chǎn)物測序未見KRAS突變，COLD-PCR條件擴增的產(chǎn)物測序有KRAS突變。不但證實了方法二的準(zhǔn)確性，還說明與常規(guī)PCR相比，COLD-PCR能更好的富集突變，提高了下游測序檢測突變的敏感性。
　　結(jié)論:1.本研究成功建立了基于Taqman探針聯(lián)合DNA結(jié)合染料的COLD-PCR法，最低檢測限為5％，比常規(guī)PCR+Sanger測序法的15％-20％高。該方法能用血液樣本，具有無