雙探針實(shí)時(shí)PCR快速檢測結(jié)核桿菌利福平耐藥基因突變的研究.pdf

1、目的： 結(jié)核病是對人類健康威脅最嚴(yán)重的傳染疾病之一。與此同時(shí)由于結(jié)核桿菌耐藥株出現(xiàn)的日益增加，使我們控制結(jié)核的能力大大減弱。利福平(RFP)是結(jié)核病化療的基石，然而耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)大大消弱了它的作用。據(jù)報(bào)道，約有90％的利福平耐藥結(jié)核桿菌對其他多種抗結(jié)核藥物也存在耐藥。因此，對利福平耐藥結(jié)核桿菌的研究成為了國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。 在結(jié)核病的治療中，最初選擇有效藥物是關(guān)鍵，所以快速檢測其敏感性或耐藥性就變得非常重要。目前

2、，對結(jié)核桿菌耐藥性的診斷方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，由于結(jié)核桿菌特別是耐藥的結(jié)核桿菌生長緩慢，傳統(tǒng)的培養(yǎng)需要4-8周，這不利于疾病的及時(shí)治療。在國內(nèi)外的基因研究證實(shí)，多重藥物耐藥的原因在于藥物作用區(qū)的基因編碼逐步獲得突變或藥物代謝酶的產(chǎn)生。超過95％的耐利福平結(jié)核桿菌與其rpoB基因上的81bp核心區(qū)域突變有關(guān)。而對利福平敏感的結(jié)核桿菌在此區(qū)域沒有突變發(fā)生。因此對這一基因的分析可以達(dá)到診斷RFP耐藥的目的。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些

3、新的方法，如：DNA測序法、PCR-SSCP法等。DNA測序法需要昂貴的儀器，限制了它的廣泛應(yīng)用。PCR-SSCP法不能確定突變位置和性質(zhì)，并受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大?？傊?，對結(jié)核桿菌耐藥的診斷方法處于進(jìn)一步完善和發(fā)展之中。 本課題選擇的雙探針實(shí)時(shí)PCR結(jié)合了MGB探針的特異和實(shí)時(shí)PCR快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)。MGB探針是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種廣泛用于單核苷酸突變的檢測的技術(shù)，具有良好的穩(wěn)定性和特異性。MGB探針在熒光定量分析中的優(yōu)越性體現(xiàn)在：

4、①理想條件下，與模板完全匹配的探針其Tm值應(yīng)該稍微高于引物延伸的溫度，而有單個(gè)堿基錯(cuò)配的探針其Tm值應(yīng)該比引物延伸溫度更低一些，MGB探針能滿足這個(gè)條件。②MGB探針另一個(gè)顯著特征是背景熒光低(在第一個(gè)循環(huán)的熒光)，這是由于MGB探針報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離較短及在結(jié)構(gòu)上具有其它更有效淬滅熒光的因素，所以背景值低。③MGB探針具有很好的敏感性和定量效果，不存在與高度復(fù)雜的DNA非特異性作用的問題。 以MGB探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量P

5、CR技術(shù)具備實(shí)驗(yàn)操作簡便、費(fèi)用低、時(shí)間短、結(jié)果可靠等其他方法無法比擬的特點(diǎn)，能快速準(zhǔn)確的單基因位點(diǎn)的突變。我們采用這一技術(shù)檢測結(jié)核桿菌rpoB基因突變，以期達(dá)到快速診斷結(jié)核桿菌RFP耐藥，為臨床提供及時(shí)有效的化療指導(dǎo)。所以，雙探針實(shí)時(shí)PCR快速檢測結(jié)核桿菌利福平耐藥技術(shù)的應(yīng)用有著影響深遠(yuǎn)的臨床意義。 方法： 一、實(shí)驗(yàn)對象： 本實(shí)驗(yàn)所用50例經(jīng)臨床確診的結(jié)核病患者痰標(biāo)本均來自聊城市傳染病醫(yī)院。H37Rv結(jié)核分枝桿菌

6、標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株購自北京生物制品檢定所。藥敏試驗(yàn)參照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、結(jié)核桿菌培養(yǎng)：采用改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法進(jìn)行。 2.對臨床標(biāo)本分離的結(jié)核桿菌標(biāo)本用經(jīng)典培養(yǎng)方法做利福平藥敏試驗(yàn)。選擇耐藥菌株和敏感菌株。 3.我們通過DNABank檢索結(jié)核桿菌rpoB基因庫，得到rpoB基因的序列，利用oligo6Blast軟件設(shè)計(jì)一對結(jié)核桿菌特異性引物。根據(jù)rpoB基因已知常見突變位點(diǎn)，包

7、括：531位點(diǎn)、526位點(diǎn)、516位點(diǎn)、520位點(diǎn)、522位點(diǎn)設(shè)計(jì)出5條MGB探針和一條結(jié)核桿菌特異性探針。 4、提取培養(yǎng)產(chǎn)物的DNA，用MGB探針實(shí)時(shí)PCR方法檢測結(jié)核桿菌rpoB基因點(diǎn)突變，分析其突變與RFP耐藥的關(guān)系。 5、DNA測序檢測結(jié)核桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)。 結(jié)果： 一、50例臨床標(biāo)本用經(jīng)典的結(jié)核桿菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)后結(jié)果均呈陽性。 二、利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果，50例標(biāo)本中12株耐藥，38

8、株敏感。耐藥率為24％。 三、MGB探針實(shí)時(shí)PCR方法檢測結(jié)核桿菌rpoB基因突變，50例標(biāo)本中有13例發(fā)生基因突變，突變率占26％；其中，利福平藥敏試驗(yàn)檢出的12株耐藥菌株全部出現(xiàn)基因突變；38株敏感菌株中有一例出現(xiàn)基因突變；發(fā)生突變的13例標(biāo)本中，有12例在531位點(diǎn)出現(xiàn)突變，突變百分率為24％，2例在526位點(diǎn)出現(xiàn)突變，突變百分率為4％，其中有一例發(fā)生了531、526雙位點(diǎn)突變。 四、比較結(jié)果，50例標(biāo)本中有13例

9、發(fā)生了基因突變，突變率占26％；其中，12株耐藥菌株全部出現(xiàn)基因突變，突變率達(dá)到了100％；38株敏感菌株有一例出現(xiàn)基因突變；發(fā)生突變的13例中，有12例是發(fā)生在531位點(diǎn)，2例發(fā)生在526位點(diǎn)，其中有一例發(fā)生了531、526雙位點(diǎn)突變。通過與傳統(tǒng)的利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較，熒光實(shí)時(shí)PCR法的敏感性達(dá)100％。 五、DNA測序結(jié)果表明，MGB探針實(shí)時(shí)PCR方法檢測的結(jié)核桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)與DNA測序結(jié)果完全相符。 結(jié)