耐藥結(jié)核分枝桿菌基因突變熱點篩查與檢測技術(shù)平臺的建立.pdf

1、為建立一種高通量、低成本、方便快速的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變篩查技術(shù)平臺,該研究構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌rpoB,rpsL,embB和katG四種基因的野生型重組質(zhì)粒,建立并優(yōu)化了PCR擴增條件、單鏈DNA模板的制備條件和焦磷酸測序分析的參數(shù).并應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)平臺對臨床82例耐藥結(jié)核分枝桿菌分離株的四種基因突變熱點進行篩查分析.研究結(jié)果表明,焦磷酸測序技術(shù)平臺完全可以用于結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因高突變區(qū)域點突變的微測序篩查分析研究;突

2、變篩查結(jié)果表明,在耐藥的菌株中存在不同程度的突變,katG315、rpoB526、rpoB531和embB306基因位點的突變頻率與文獻報道比較相符,未篩查到rpsL43基因位點的突變,而rpsL88基因位點的突變頻率稍高于文獻報道.突變篩查還發(fā)現(xiàn)一種新的基因突變位點rpoB517 CAG→TAG,和一種新的基因突變形式embB306 ATG→AGG.研究結(jié)果提示rpoB,rpsL,embB和katG等基因的點突變是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥

3、性的根本原因之一.突變篩查結(jié)果對結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因診斷方案的建立具有重要的指導(dǎo)意義.為建立一種適合臨床應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因診斷技術(shù),我們根據(jù)Pyrosequencing突變篩查結(jié)果,選取了結(jié)核分枝桿菌katG315、rpoB526、rpoB531、embB306和rpsL88作為待分析基因位點,構(gòu)建了以上基因位點的突變型和野生型重組質(zhì)粒,建立并優(yōu)化了TDI-FP技術(shù)的實驗參數(shù)與條件.應(yīng)用重組質(zhì)粒作為標準對照樣品,我們對經(jīng)過焦