結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制及其快速檢測方法的建立.pdf

1、結(jié)核病(TB)是當(dāng)今全球范圍對人類最具威脅性的感染性疾病之一，是單病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于結(jié)核病的人數(shù)接近200萬。中國是全球結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)，結(jié)核病發(fā)病總?cè)藬?shù)居全球第二，每年死于結(jié)核病者約25萬，結(jié)核病奪去的生命多于其它所有傳染病所造成死亡例數(shù)的總和。耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生和傳播及結(jié)核合并HIV感染是造成近年柬結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來的主要原因。目前對結(jié)核病治療主要使用化學(xué)藥物，然而由于抗結(jié)核藥物的不規(guī)范治療

2、，病人體內(nèi)的結(jié)核菌對多種抗結(jié)核藥物發(fā)生耐藥，從而形成耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)，這是結(jié)核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中國結(jié)核病疫情的主要特點(diǎn)之一就是耐藥率高，耐多藥結(jié)核病人數(shù)居全球第一。因此深入開展結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制研究及在此基礎(chǔ)上建立適合臨床應(yīng)用的快速耐藥檢測方法，對于指導(dǎo)結(jié)核病臨床治療，控制耐多藥結(jié)核病的傳播，以及開發(fā)新型抗結(jié)核藥物均具有重大的理論意義和實(shí)用價值。 利福平(RFP)和異煙肼(INH)作為快速全效殺菌

3、劑，是目前最重要的一線抗結(jié)核藥物，是當(dāng)今短程抗結(jié)核化療的基礎(chǔ)。在結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的研究中占據(jù)重要地位。乙胺丁醇(EMB)也是重要的一線抗結(jié)核藥物，具有廣譜抗分枝桿菌活性。然而分枝桿菌對EMB產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制仍不十分清楚，各國學(xué)者的研究報道仍存在較多爭議，亟待進(jìn)一步研究。本文應(yīng)用DNA測序技術(shù)分析87株來源于河南省結(jié)核病耐藥監(jiān)測項目收集的結(jié)核分枝桿菌分離株，其中對RFP、INH、鏈霉素(SM)和EMB均敏感的35株，具有不同耐藥模式

4、的耐藥株52例，其中耐RFP 47例，耐INH 49例，耐EMB 28例。對所有菌株的耐藥相關(guān)基因rpoB、 katG、 inhA調(diào)節(jié)區(qū)和embB的突變熱點(diǎn)區(qū)同時進(jìn)行基因型分析。結(jié)果顯示47例耐RFP分離株中，43株(91.5％)在利福平耐藥性決定區(qū)(RRDR)出現(xiàn)基因突變。共檢出15種錯義突變類型，涉及15種氨基酸改變。最常見的突變類型發(fā)生在531密碼子上，共占全部突變株的58.1％(25/43)。49例耐INH分離株中，36例(73

5、.5％)檢出基因突變，且發(fā)生在315密碼子位點(diǎn)。序列分析覆蓋了inhA調(diào)節(jié)區(qū)的DNA序列，共檢出4例 (8.2％，4/49)在-15堿基位點(diǎn)發(fā)生C→T的置換。其中，1例同時伴隨katG點(diǎn)突變，另3例不伴隨katG點(diǎn)突變。79.6％(39/49)的耐INH分離株至少在katG 315位點(diǎn)或inhA調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生一種突變。28例EMB耐藥株中，16例(53.4％)在embB 306密碼子發(fā)生基因突變，突變類型包括M306V(ATG→GTG)，M

6、306L (ATG→CTG)，M306I(ATG→ATA)，M306I(ATG→ATT)和M306I(ATG→ATC)5種類型。其中M306I(ATG→ATC)突變類型為國內(nèi)首次報道。在24例對EMB敏感而對RFP和INH耐藥的菌株中，4例(16.7％)也在306密碼子位點(diǎn)檢出基因突變。而對RFP、INH、SM和EMB均敏感的35例結(jié)核分枝桿菌分離株中，它們的rpoB、 katG、 inhA調(diào)節(jié)區(qū)和embB基因均未檢出相應(yīng)的突變。對rp

7、oB、katG與embB306位點(diǎn)的突變對比分析。研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌耐RFP主要由rpoB基因突變引起，最常見的突變類型發(fā)生在531密碼子。耐INH與katG基因和inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)突變有關(guān)，且katG 315密碼子位點(diǎn)突變是主要因素。研究結(jié)果也初步揭示embB306位突變可能并不是結(jié)核分枝桿菌對EMB產(chǎn)生耐藥的直接原因，而可能與耐多藥產(chǎn)生相關(guān)。 本文首次對耐藥結(jié)核分枝桿菌embB306位點(diǎn)與rpoB基因和katG基因突變

8、的相關(guān)性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明耐藥結(jié)核分枝桿菌embB306位點(diǎn)突變同時伴隨rpoB基因突變?yōu)?00％(19/19)，高于同時伴隨katG315位點(diǎn)突變(73.7％，14/19)。為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌耐多藥與EMB耐受的分子機(jī)制提供了必要的信息。本研究結(jié)果為研制和開發(fā)耐藥結(jié)核分枝桿菌快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。 長期以來結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)一直是結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷中至關(guān)重要的技術(shù)。但傳統(tǒng)的結(jié)核病藥敏檢測方法為表型耐藥檢測方法，其

9、建立在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，通常至少需要4到6周的時間，遠(yuǎn)不能滿足臨床治療的需要。因此基于當(dāng)前結(jié)核病分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，本文建立和評價了一種新型的快速進(jìn)行利福平和異煙肼耐藥檢測的反向系列探針雜交方法。應(yīng)用該方法設(shè)計了一個放置了18條探針的多重寡核苷酸探針陣列，可以同時檢測與FRP和INH耐藥相關(guān)的rpoB、katG、inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和ahpC基因內(nèi)間隔區(qū)的堿基突變，并同時可對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群進(jìn)行鑒別診斷。應(yīng)用本研究建立的方法

10、檢測52株耐多藥結(jié)核分枝桿菌，46株(88.5％)在rpoB突變熱點(diǎn)區(qū)檢出突變。與rpoB的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果對比分析，探針陣列上野生型探針檢測RFP耐藥與測序的結(jié)果符合率是98.1％(51/52)，突變型探針檢測結(jié)果的符合率是100％(52/52)。應(yīng)用本研究建立的方法，86.5％(45/52)的耐INH分離株在katG315位點(diǎn)，或inhA調(diào)節(jié)區(qū)，或ahvC基因內(nèi)間隔區(qū)檢測到至少一種突變。選擇10例INH耐藥和10例INH敏感株，對

11、katG、inhA基因調(diào)節(jié)區(qū)和ahpC基因內(nèi)間隔區(qū)進(jìn)行測序分析，探針陣列上野生型探針和突變型探針的檢測結(jié)果均與測序結(jié)果一致。應(yīng)用該方法檢測35例敏感株的耐藥相關(guān)基因，均未檢出突變?？傮w上，與傳統(tǒng)的表型耐藥檢測結(jié)果相比，反向系列探針雜交方法檢測RFP耐藥的敏感性是88.5％(46/52)，特異性是100％(35/35)；檢測INH耐藥的敏感性是85.5％(45/52)，特異性是100％(35/35)。反向系列探針雜交方法提供了一次雜交實(shí)驗(yàn)

12、即可快速獲得結(jié)核桿菌對多種藥物的耐受信息，使得結(jié)核桿菌分離株耐藥性檢測從常規(guī)的4-6周的時間縮短到6-8h，充分顯示了常規(guī)方法不可比擬的優(yōu)越性。因此有可能發(fā)展成為應(yīng)用于臨床快速耐藥檢測的新方法，這種反向系列探針雜交方法也可以用于耐多藥結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查和研究，為耐藥結(jié)核病的控制起到重要作用。 目前分枝桿菌的發(fā)病率也呈上升趨勢，由于非結(jié)核分枝桿菌(NTM)對大多數(shù)抗結(jié)核藥物天然耐受，并且NTM的傳播途徑與結(jié)核病的人一人的傳播途徑

13、不同，因此快速、準(zhǔn)確對結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病進(jìn)行鑒別診斷，并針對性的對患者采取有效的治療和控制措施非常重要。傳統(tǒng)的分枝桿菌菌株鑒定方法經(jīng)常與藥敏檢測同步進(jìn)行，也是建立在分枝桿菌的培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，費(fèi)時、費(fèi)力，且時常不能給出明確的結(jié)果，難以滿足臨床治療的需要。因而建立結(jié)核分枝桿菌快速耐藥檢測方法的同時，不可回避地需要建立對分枝桿菌同步進(jìn)行快速菌種鑒定的檢測方法。基于反向系列探針雜交技術(shù)，本研究選擇分枝桿菌16S-23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間

14、隔區(qū)為靶DNA序列，設(shè)計一個新型的多重寡核苷酸探針陣列，包括16個屬、群和種特異性探針。應(yīng)用該技術(shù)檢測126例來自中國河南省結(jié)核病耐藥監(jiān)測項目的臨床分枝桿菌分離株。其中結(jié)核分枝桿菌56株，牛型分枝桿菌8株，非結(jié)核分枝桿菌62株。結(jié)果顯示多重探針陣列中分枝桿菌屬特異探針和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群群特異探針具有100％的特異性和敏感性。80.4％(50/62)的非結(jié)核分枝桿菌分離株被直接鑒定到種的水平。通過BLAST和RIDOM對國際上現(xiàn)存的16

15、S-23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列進(jìn)行比對分析，并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)存在多態(tài)性。本研究所發(fā)現(xiàn)的一些新的分枝桿菌基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列型(sequevar)已經(jīng)在Genbank中登記。反向系列探針技術(shù)從分枝桿菌菌株處理到菌種鑒定結(jié)果判斷僅需6-8個h，與傳統(tǒng)所需4-6周的時間相比，顯示了巨大優(yōu)越性。并且通過大量的整合試驗(yàn)，本探針陣列從菌株DNA提取

16、、PCR擴(kuò)增、分子雜交和酶聯(lián)顯色全套過程可以與結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測探針陣列同步進(jìn)行，成為結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測的配套技術(shù)。隨著在Genbank中積累更多的分枝桿菌基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列信息，對設(shè)計的探針進(jìn)一步完善和優(yōu)化，本研究建立的反向系列探針技術(shù)有可能成為臨床快速、準(zhǔn)確進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定的新方法。本文在對結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)本研究建立的寡核苷酸探針陣列核心技術(shù)平臺，建立了一套可以同步進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌RF